基因工程原理

28图3-21钙诱导的转化二、重组体的遗传学筛选法所谓遗传学方法(geneticselection)主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型的变化直接选择重组体的方法。遗传表型的变化包括抗药性、缺陷基因的功能互补表型及噬菌斑的变化等。这些表型的变化有些是载体提供的表型特征，有些则是插入序列提供的表型特征。选择的方法主要是根据平板上可见的表型变化，用于选择的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表达抗生素平板、显色平板等，由于这些方法都是直接从平板上筛选,所以又称为平板筛选法。(一)插入失活筛选法从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后，使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insertionalinactivation)。弓储'一物I互讣5JIW1I生扑与引物I!1L卡卜5趣融苗景祚，〜弓L物结介1曲姐的双联口村人弓储'一物I互讣5JIW1I生扑与引物I!1L卡卜5趣融苗景祚，〜弓L物结介1曲姐的双联口村人区分离井r与引物退火5*新中初川物延伸-j，见物1H补^5J用物延伸jrtrtfttjrna升段图3-22插入失活的原理图3-23聚合酶链反应(引自Watsonetal,1992).抗性基因插入失活筛选法根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的PBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的，表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是,如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段，就会造成四环素抗性基因失活，变成AprTcs,携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长，而不能在四环素抗性平板上生长(图3-22)。.蓝白斑筛选法根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制，才能够将所需的重组体挑选出来，大大增16胡耳加了筛选的工作量。后来，人们设计了以B-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体，简化了筛选程序，提高了灵敏度。这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因，它编码B-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的a-肽，载体转化的受体菌为lacZAM15基因型。这样，载体同宿主通过互补，具有完整的B-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA,造成lacZ基因失活，不能合成a-肽，失去同宿主的互补，不能形成有功能的B-半乳糖苷酶，失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上，含阳性重组体的细菌为物色菌落（质粒载体）或无色噬菌斑（M13噬菌体载体）；非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。显色反应筛选方法比较简单，但是B-半乳糖苷酶的合成需要诱导。实验中起诱导作用的是安慰诱导物一IPTG（异丙基硫代-B-D-半乳糖苷），作用底物是X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷）。通常是将X-gal和IPTG混合后,涂布在固体平板的表面。（二）PCR法聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外扩增特定DNA序列的新技术，这种DNA的体外扩增是通过同DNA双链互补的两个引物在DNA聚合酶的作用下，进行引物延伸来完成的。在反应系统中，需要有：①模板（含有特定序列的DNA分子）。②两个寡聚核苷酸引物，这两个引物可同双链DNA分子的互补链杂交，并且位于靶DNA欲扩增区的两侧。③耐热DNA聚合酶。④4种脱氧核糖单核苷酸。然后经过不同温度的循环进行DNA扩增（图3—23）。这一技术是KaryMullis在1985年发明的，并于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR应用十分广泛，并且可通过菌液PcR进行重组克隆的快速筛选。基本方法是从抗性平板上挑取单菌落接种至250PL的LB培养基中，200r/min振荡培养8h以后，取1DL菌液进行裂解制备模板进行PCR筛选。（三）核酸杂交筛选法核酸杂交又叫分子杂交（molecularhybridization）,是鉴定和筛选重组体的一种方法。原理是：两条具有碱基互补序列的DNA分子变性后，在溶液中一起进行复性时，可以形成杂种双链DNA分子。同样，一条DNA链与之具有互补碱基序列的RNA链在一起复性时，也能形成双链结构（DNA-RNA杂交体）。杂交包括下列过程：①DNA的“熔解”，即变性，目的是使双螺旋解开成为单链，这可将DNA溶液的温度升高超过Tm值（解链温度）即可；②退火，即DNA的复性，将加热过的DNA溶液缓慢冷却即可发生。杂交的双方是待测的核苷酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未经克隆的基因组DNA或是细胞总RNA。核酸杂交方法的两个特点是高度特异性及高度灵敏性。菌落杂交在大量筛选重组的细菌细胞时,需要从中寻找出为数极少的含有目的序列的细胞。另外.在利用插入失活、显色反应等手段得到含重组质粒的细菌细胞后,还需要证明这些重组质粒是否含所需要的目的序列。若将所得菌落逐个扩大培养，提取质粒DNA,然后用Southern杂交法固然可以鉴定重组质粒，不仅工作量大，又耗费财力，用菌落杂交（colonyhybridization）（图3-24）,就方便得多。首先要将转化的受体菌在合适的琼脂平板上制成单菌落,然后将菌落复制到硝酸纤维素滤膜上,保留主平板,将硝酸纤维素滤膜上的菌落进行原位溶菌、原位释放DNA、原位进行DNA变性、中和洗涤后进行原位固定。然后同特异的探针进行杂交,通过放射自显影后,有杂交信号的即为重组体,对照主平板则可将重组体选择出来。

图3-24菌落杂交的基本过程(引自Old&Primrose,1980)Southern杂交Southern杂交(Southernhybridization)是1975年Southern建立起来的一种杂交方法，属固相-液相杂交。该法的主要特点是利用可毛细现象将DNA转移到固体支持物上,称为Southern转移或Southern印迹(Southernblotting)o它首先用合适的限制性内切酶将DNA切割后，进行电泳分离后，利用干燥的吸水纸产生毛细作用，使液体经过凝胶，从而使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面，然后进行杂交(图3-25)。图3-25Southern杂交中的DNA转移(引自Albertsetal.2002)Northern杂交Northern杂交(NorthernHybridization)是分析RNA的一种方法,它的基本原理是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离,再转移到尼龙膜等固相膜载体上,用放射性同位素标记的DNA或RNA特异探针对固定于膜上的mRNA进行杂交,洗膜去除非特异性杂交信号,经放射自显影,对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA分子在电泳中的迁移位置与标准分子量分子进行比较,即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小,对杂交信号的强弱比较,可以知道该基因表达mRNA的强弱。这一技术应用十分广泛,常用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。主要用来检测外源基因在受体细胞中是否转录成RNA。Northern印迹的原理同Southern印迹。但有两点不同：其一是转移的对象不同，Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。其二，虽然RNA电泳前不需向DNA那样进行酶切，但也需要变性。不过变性方法是不同的，它不能用碱变性，因为碱变性会导致RNA的水解。Northern杂交与Southern杂交的主要区别是在变性剂存在下，用琼脂糖进行电泳分离RNA。变性剂的作用是防止RNA的二级结构发夹环的形成，保持其单链线性状态。第六节生物技术及应用基因工程技术的发展推动了生物技术(biotec}lnokogy)的发展，现代生物技术作为一门综合性的学科，与现代微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学和化学工程等多学科密切相关。生物技术产业从20世纪80年代开始起步，经过20年的发展，目前在农牧业、食品、医药等领域得到广泛的应用。生物技术产业市场逐渐形成，其前景广阔，将成为21世纪经济的支柱产业。(一)细胞工程细胞工程(cellengineering)是利用细胞的全能性，在细胞或细胞器水平上改变细胞的某些遗传特性，以改良其性状、获得有用基因产物或加速细胞及生物体繁殖的综合技术，可分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程，是以细胞培养技术为基础，通过细胞融合、细胞核移植、动物克隆、染色体工程和生物反应器来实现。1■■■■■细胞融合(cellfusion)又称体细胞杂交(somatichybridization)，是指两个不同来源的细胞，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，打破远缘生物不能杂交的屏障，形成新物种或新品种的技术。1975年，英国剑桥大学的科学家科莱尔(G.Kohler)和米尔斯坦(CMilstein)用细胞融合技术将能分泌抗体的B淋巴细胞(绵羊红细胞、免疫小鼠脾细胞)与具有无限生长能力的肿瘤细胞(小鼠骨髓瘤细胞)融合，得到了既能持续产生单一抗体又能在体外无限繁殖的杂合细胞(杂交瘤细胞，hybridomacell)(图3-26),通过细胞培养将杂合细胞克隆为单纯的细胞系(单克隆系)，由此类细胞系可获得结构和特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)。这一技术的创立在生物医学领域取得重大突破，两位科学家因而荣获1984年诺贝尔生理医学奖。

图3—26利用细胞融合技术制备单克隆抗体（引自Kuby,1994）如今这种细胞融合技术已在动物间实现了小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，甚至于小鼠和人等许多远缘和超远缘的体细胞杂交。虽然目前动物的杂交细胞还只停留在分裂传代的水平，不能分化发育成完整的个体，但在理论研究和基因定位上都有重大意义。而植物间的细胞融合所得到的杂交细胞，获得了新的杂交植物，如西红柿与马铃薯细胞融合获得“西红柿马铃薯”，羽衣甘蓝与白菜型油菜细胞融合得到“甘蓝型油菜”等。2.细胞核移植细胞核移植是将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的显微操作技术。由于主要遗传物质存在于细胞核内，因而此技术可获得遗传上具同质性状的动物，对动物优良杂交种的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种具有重大意义。1952年，美国科学家布里格斯（R.Briggs）首次利用豹纹蛙卵细胞建立了细胞核移植技术。1981年，瑞士科学家K.IUmenses率先对哺乳动物小鼠卵细胞进行核移植获得成功。他将灰鼠的细胞核注入到除去了精核和卵核的黑鼠的受精卵内，然后再将这一f'Fh黑鼠细胞质和灰鼠细胞核组成的卵细胞体外培养，得到的仔鼠是灰色的，说明仔鼠的性状取决于细胞核的来源。在细胞核移植技术上发展起来的动物体细胞克隆技术在1997年因克隆羊“多莉”（Dolly）的诞生而取得了重大突破。英国科学家维尔穆特（Iwilmut）等1997年2月27日在《自然》描述了“多莉”的克隆过程（图3-27）。他们取出六龄的芬兰多塞特白绵羊母羊的乳腺细胞核，将此核导入苏格兰黑绵羊去核的卵细胞内，待手术完成之后，以相同频率的电脉冲刺激换核卵，让苏格兰黑绵羊的卵细胞质与芬兰多塞特白绵羊母羊乳腺细胞的核相互协调，使这个“组装”细胞在体外发育成早期胚胎，然后将胚胎植入另一只母羊的子宫内，产下了小绵羊“多莉”。“多莉”不是由母羊的卵细胞和公羊的精细胞受精的产物，而是体细胞核加去核的卵细胞质，不经两性结合诱导出来的胚胎产生的。“克隆羊”的诞生表明：动物体中执行特殊功能、具有特定形态的所谓高度分化的细胞与受精卵一样具有发育成完整个体的潜在能力。

图3—27克隆羊“多莉”诞生的过程(引自Glick&Pasternak,1998)1998年，日本科学家利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生；同年，美国科学家用成年鼠的体细胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠；1999年，夏威夷大学的科学家利用成年鼠体细胞克隆出第一只雄性老鼠；2000年1月，美国科学家宣布克隆猴成功，这只恒河猴被命名为“泰特拉”；同年3月，曾参与克隆小羊“多莉”的英国PPL公司宣布，他们成功培育出5头克隆猪。2002年，我国科学家成功克隆出牛和山羊，使我国成为少数掌握体细胞克隆哺乳动物关键技术的国家之一。2003年，美国、意大利等国科学家分别培育出世界上第一匹克隆骡子和克隆马。中国和法国科学家合作首次克隆出大鼠。(二)蛋白质工程蛋白质工程是根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要特性的特殊蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，能更快、更有效地为人类服务。重组人p干扰素(IFNp)的人工改造是蛋白质工程的一个成功范例。干扰素(interferon)是人体细胞分泌的一种蛋白质，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，是人体防御系统的重要组成部分。重组人IFNB是采用重组DNA技术，克隆人B干扰素基因，构建合成干扰素的基因工程菌，经发酵、提纯、纯化制备而成。其基因工程产物活性为10万U/mg，仅是天然IFN口产物活性的10%。蛋白质结构分析发现，人IFNB由154个氨基酸组成，在17、41、141位有3个半胱氨酸(Cys)，人体天然产物在41、141间形成二硫键，基因工程产物二硫键位置有偏差，17位Cys的巯基参与二硫键，形成无活性的二聚体或寡聚体。由于丝氨酸(Ser)与半胱氨酸在结构上除羟基(-OH)与巯基(-SH)外完全一样，因此将17位Cys点突变为Ser，结果证明人工改造的IFN口产物活性提高100倍，稳定性好于天然产物。(三)酶工程酶工程(enzymeengineering)就是通过对酶的修饰改造，提高酶的催化效率并在某一生物反应器中大规模生产的技术过程，主要包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶分子修饰、酶和细胞固定化、酶反应动力学与反应器、酶的应用等。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中(表3—4)。例如，固定化青霉素酰化酶用于连续裂解青霉素生产；a-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶连续作用于淀粉，就可以生产出各类糖浆；利用葡萄糖苷酶可生产出低糖啤酒；蛋白酶用于除去毛皮中的特定蛋白，软化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生产的嫩肉粉等,都是酶工程的产物。此外，酶工程还用于农副产品的加工利用。美国利用大豆生产出200余种产品，包括营养食品、药品、食品添加剂等，例如高纯度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。目前工业生产的酶有60余种，其中规模化生产仅20余种。表3—4酶工程的主要应用领域应用领域酶类主要用途

淀粉酶类蛋白酶类糖化酶食品工业葡萄糖异构酶葡萄糖苷酶凝乳酶果胶酶淀粉酶类纺织工业纤维素酶日化工业蛋白酶类淀粉酶类蛋白酶类糖化酶食品工业葡萄糖异构酶葡萄糖苷酶凝乳酶果胶酶淀粉酶类纺织工业纤维素酶日化工业蛋白酶类

蛋白酶类

淀粉酶类糖酐酶制革工业蛋白酶类青霉素酰化酶羟化酶酪氨酸酶蛋白酶类高果糖浆生产低糖啤酒生产乳酪生产果酒、果汁去浊纺织品褪浆处理纤维制品，提高棉毛纺织品质量丝制品脱胶处理加酶洗涤剂、加酶护肤品与化妆品生产超氧化物歧化酶化妆品生产加酶洗涤剂生产牙膏添加剂超氧化物歧化酶化妆品生产皮革去毛、软化青霉素、头孢霉素生产氢化可的松生产多巴（主治帕金森病）生产氨基酸、蛋白水解液生产，治疗消化不良，消肿，降压等葡萄糖脑苷酯酶治疗高雪病（葡萄糖脑苷酯酶缺乏症）医药工业天冬酰胺酶溶菌酶尿激酶治疗白血病医药工业天冬酰胺酶溶菌酶尿激酶消炎，镇痛，止血等治疗心肌梗死、结膜出血等超氧化物歧化酶治疗红斑狼疮、皮肌炎、辐射损伤等治疗血栓性静脉炎、血肿等多种疾病诊断（如葡萄糖氧化酶诊断糖尿病，胆碱酯酶诊断肝炎等）处理造纸工业废水处理高有机物含量废水处理酿酒工业废水链激酶其他多种酶淀粉酶类溶菌酶环保工业丁酸梭菌酶系其他多种酶（四）发酵工程环境监测试剂（如胆碱酯酶监测有机磷农药，硫氰酸酶监测氰化物等）发酵工程（fermentationengineering）是利用微生物的特性，通过现代化工程技术，在反应器中生产目的产物或提供所需服务的技术过程。“发酵”一词来源于拉丁语动词链激酶其他多种酶淀粉酶类溶菌酶环保工业丁酸梭菌酶系其他多种酶（四）发酵工程发酵工程由3部分组成（图3—28）：上游工程、发酵过程和下游工程。其中上游工程包括优良菌株的选育、最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成的确定、营养物的准备等。发酵过程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。这里要有严格的无菌生长环境，包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术，在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术，在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术，还有种子培养和生产培养的不同的工艺技术。图3—28发酵工程的基本流程微生物发酵产品可分为以下几大类：.微生物细胞（生物量）作为产品，如单细胞（酵母）蛋白作为食品或饲料。.微生物代谢物产品，目前医用抗生素、农用抗生素等已有近200个品种，绝大部分都是发酵产品。此外，发酵产品还包括酒精、氨基酸、柠檬酸和工业用酶等。味精、多种维生素等也是发酵工程的产品。.基因工程产品。微生物（如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌和酵母等）是最常用的重组基因的表达系统。主要产品包括干扰素、胰岛素、牛凝乳酶、G—CSF（粒细胞集落刺激因子）、EPO（红细胞生成素）和tPA（重组组织型纤溶酶原激活剂）等。（五）生物医学工程生物医学工程（biomedicalengineering）是综合生物学、医学和工程学的理论和方法而发居起来的新兴综合学科。生物医学工程开始以仿生学原理制造人工器官，如心脏起搏器、人造心脏、假肢等，以及用于诊疗手段的医学仪器。后来人体器官移植成为医疗中可以选择的手段，但常常要克服异体器官的排斥反应，在用药物能够解决排斥反应之前，人体器官移植成功的例子很少。由于生物技术迅猛发展，在DNA双螺旋结构发现50年后，人类基因组计划已经完成，对人类基因全面了解后，人们已经将眼光投到干细胞克隆和治疗性克隆（非生殖性克隆），一些国家如美国建立了胚胎的干细胞系，用于包括治疗性克隆等方面的研究。国外已经成功地从自体鼻窿腔内取出干细胞，导人心脏，去除心脏因炎症等留下的疤痕，恢复了心脏的正常功能，以及用血液中的干细胞修复因车祸等造成四肢瘫痪患者的脊髓神经，使他们重新站立起来。这是因为即便是成人，一些在胚胎时期存在的干细胞仍可以留存在身体的各部分，或者作为专能干细胞，也在人体的器官中，这些干细胞能够在特定的情况下进一步分化为组织。利用自体的干细胞也免除了异体器官移植糟糕的排斥反应。这种利用人体自身干细胞修复人体受损部分已经成功的例子以及治疗性克隆的前景，为解除人类的病痛带来了福音。（六）生物信息工程生物信息工程（biologicalinformationengineering）可以简单地定义为计算机与信息技术在生命科学中的应用，它是一个年轻和快速发展的领域。生物信息工程运用数学、计算机科学和生物学来阐明和理解大量生物学研究的实验数据中所包含的生物学意义，包括此类数据的采集、贮存、整理、归档、分析与可视化等。以人类基因组计划（humangenomeproject，HGP）为序幕的生物信息学研究，是全面认识生命及其过程的重要手段，由此引发的生物信息革命，将从根本上改变生命科学和生物产业的思维方式和研究体系。人类基因图谱绘制既是生物学的突破也是计算科学的壮举。在生物学家看来，存在于基因组中的碱基对序列是宝贵的生物信息资源，是未来生物工程产业的支柱。人类3万〜4万个基因的信息以及相应的染色体位置被阐明后，将成为医学和生物医药产业知识和技术创新的源泉。一些困扰人类健康的主要疾病，例如心脑血管疾病、糖尿病、肝病、癌症、老年痴呆症等都与基因有关，可以依据已知的基因序列和功能，找出这些基因并针对相应的靶位进行药物筛选，并设计新药。到2002年底，已有1500多种致病基因被标记。信息技术有史以来首次成为推动实验生物学和医学发展的主要动力。这一趋势明显地表现在所有与了解疾病起因、新药开发相关的关键领域中一一基因组学、蛋白质组学以及代谢途径的研究等，这些专业的研究需要依靠强大的计算机系统、数据和存储管理系统来完成大量的数据处理工作。而这些对生命的研究数据将帮助人类解开人体内数以万计蛋白质种类的基因编码秘密。此外，利用生物信息工程技术建立动、植物良种及相关有用基因数据库将有助于各种家畜、作物的基因改良。

四、转基因动物图3—30转基因鼠（引自Griffithsetal,1999）传统的家畜改良主要是通过多代选择性交配改良饲养动物的遗传性状，如产奶、羊毛品质、生长速度和产蛋率等。在每一轮连续世代中，那些具有优越性状的动物可作为选育良种。这种交配、选育的方式虽然费时、费力，但却很成功，现今几乎所有的家畜都经过这种改良。但是这种方法不能将单一的功能基因或基因簇引入高等动物的染色体DNA上。经过20世纪80年代不懈的努力，借助于受精卵原核显微注射和早期胚胎细胞的反转录病毒感染等手段，将基因导入受精卵产生新品种的设想已成为现实。动物转基因技术迅速成为研究哺乳动物基因表达和发育的有效手段，在建立研究人类疾病的动物模式系统中发挥着作用，还可以使动物的乳腺分泌含有药用蛋白的乳汁，因而出现了“乳腺生物反应奥，，W订O转基因技术在小鼠的研究中发展得较为成熟（图3—30）。20世纪80年代以来，已经将几百种基因导入不同的品系中。这些研究使人们对基因调控、肿瘤发生、免疫专一性、发育的分子遗传学及其他一些基本的生物活动过程有了更多的了解。转基因小鼠还可作为人类治疗药物的检测动物，不同的转基因品系可作为研究人类遗传疾病的生物医学模型。（一）基因导入动物的方法在转基因中，DNA可通过3种方式导入：①反转录病毒介导感染早期胚胎细胞，然后植入雌性动物体内。②显微注射到受精卵内膨大的精核（雄性原核）中。③基因工程处理胚胎干细胞，导入一个早期发育胚胎后再植入雌性动物体内。.反转录病毒载体法图3—31显微注射法进行动物转基因的基本过程（引自Glick&Pasternak,1998）在各种基因转移方法中，反转录病毒作为载体能够有效地使转移基因整合到受体细胞基因组中。但是，这类载体只能携带小片段（约8kb）DNA,因为长度的限制，这些转移基因可能缺少关键的相邻调控序列。使用病毒载体有一个最主要的缺陷，虽然这些载体被设计为复制缺陷型，但是用于制备大量载体DNA的病毒株的基因组可同样进入细胞核。除非采取特殊的预防措施，这些辅助病毒会在转基因个体中复制、产生。无论是直接将转基因个体作为食品，还是利用其产物，都应绝对避免病毒的污染，所以，反转录病毒介导法很少用于生产经济用途的转基因动物。.DNA显微注射法由于反转录病毒介导法的不足，显微注射DNA成为产生转基因小鼠的首选方法。整个过程包括3个主要步骤（图3-31）：①刺激供体雌性鼠超量排卵，以产生足够的受精卵用于注射。首先注射孕马血清，约48h后再注射人绒毛膜促性腺激素，一只超量排卵的小鼠可产生大约35颗卵,而不是通常的5〜10颗卵。②雌鼠经过交配，受精卵从输卵管中洗出。③立即对采集的受精卵进行显微注射。注射的转移基因通常是线性结构，不采用原核生物的载体序列。整个过程看似简单，但需要一系列实验步骤的配合，并且成功率最高也只有5%左右，所以必须对大量的卵进行注射。例如，

经注射的卵有66%的成活率，成活的受精卵25%可正常发育，25%的后代携带转移基因，那么，注射1000个受精卵,才能获得30〜50个转基因后代。并且，DNA在染色体上随机整合，在某些个体中，转移基因由于整合位点不当而不能表达，在某些个体中因拷贝数高而过度表达，这会干扰动物的正常生理活动。.胚胎干细胞法小鼠胚胎发育卵泡阶段的细胞在培养基中依然保持分化能力。当把它们重新输回胚胎胚泡后，仍保留着分化成其他细胞（包括生殖细胞）的能力，这类细胞称多能性胚胎干细胞（EScell）oES细胞在体外培养时可承受转基因操作而不影响其分化的多能性。外源基因通过同源重组可特异性整合在ES基因组内的一个非必需位点上，构成工程化胚胎干细胞。经体外筛选鉴定、扩大培养后再输回小鼠胚胎胚泡中，最终形成转基因动物（图3—32）。这种方法避免了前两种方法带来的整合随机性。内姗电团供体般洵©◎◎I植入供作受体肝泡公◎⑥蟹◎您情其因小眦诜脸汴射胚泡内姗电团供体般洵©◎◎I植入供作受体肝泡公◎⑥蟹◎您情其因小眦诜脸汴射胚泡图3—32胚胎干细胞基因转化法（引自Glick&Pasternak,1998）（二）转基因动物的应用转基因动物具有广阔的应用前景，目前主要应用于以下几个方面：①利用动物转基因技术研究基因的表达与功能。②利用转基因动物或细胞生产生物大分子。③利用转基因技术进行动物遗传性状改良的研究。④基因治疗。.乳腺生物反应器由于基因工程技术的出现，人类已可以大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究或治疗疾病。可以完成这件工作的系统有细菌发酵、真核细胞培养和乳腺生物反应器等3种主要生产方式。在这3种生产方式中，乳腺生物反应器有特殊优点。乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机制，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物（图3—33）。

含有目的蛋白的乳汁『危桓地分潮fl的小n含有目的蛋白的乳汁『危桓地分潮fl的小n的母羊C7：O/蚩白的分离蚪i化日的小冏蛋白图3—33用转基因绵羊生产重要的医用蛋白质(引自川@$加9etal,l994)乳腺生物反应器是一项综合技术，发展乳腺生物反应器不仅需要基因工程技术，还需要动物胚胎技术、转基因技术、蛋白质提纯技术和常规畜牧技术。到目前为止，世界各国科学家已经制造出乳腺分泌各种医用蛋白质的牛、山羊、绵羊、猪和家兔，乳腺分泌的蛋白质达到可商业开发水平的转基因动物达十多种。.转基因鼠在揭示人类分子病病理中的应用转基因小鼠可作为研究人类疾病的模式系统，或对某种可能的药物进行检测。完整的动物模式应模拟人类疾病的发生和发展过程，但是，小鼠毕竟不是人类，所以，从转基因模型得到的信息在医学上并不总具有相关性，不过，在研究复杂疾病时，可对致病原因的发现带来突破性进展。现已发展了多种转基因小鼠模型用来研究人类遗传疾病，例如阿尔茨海默病(Alzhaeirnerdisease)、关节炎(arthritis)、肌肉萎缩症(muscularddystrophy)、肿瘤发生(tumorigenesis)、高血压(hypertension)、神经退行性病变失调(neurodegenerativedisorder)、内分泌功能异常(endocrinologicaldysfunction)和冠心病(coronarydisease)等。Alzheimer病是一种大脑机能退行性失调，表现为精确思维能力和记忆力的持续丧失，伴随性格改变、语言紊乱和身体机能的迟钝。虽然1%的60〜65岁人群和30%的80岁以上人群可能患此病，但该病的临床诊断仍很不足。在患者脑部的新皮质和海马部位，神经元胞体内出现神经元纤维的缠结，在轴突终端生成密集的胞外聚集物”衰老斑”，脑细胞(神经元)逐渐死亡。在患者脑血管中也发现这种称为“淀粉样小体”的聚集物。衰老斑与淀粉样小体的基本组分是一种相对分子质量4X103的蛋白AB(amyloidB,8-蛋白、8-淀粉样蛋白、B-A4)。组成各种AB蛋白的氨基酸残基数目不同，如AB40、AB42。所有的AB蛋白都是B-淀粉样前体蛋白(APP)自身水解生成的。目前还不知道AB积累的原因。在一些Alzheimer病高危家族中发现了APP基因的突变，显示APP/r/