1.2 微生物的培养技术及应用 课件-2021-2022学年人教版（2019）高中生物选择性必修3课件

第1章发酵工程第2节微生物的培养技术及应用一、微生物的基本培养技术什么是培养基？如何配制？什么是无菌技术？本节聚焦123怎样进行酵母菌的纯培养？♣微生物概述微生物的概念：_________________________的统称。包括_______________________________等。本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。难以用肉眼观察的微小生物细菌、真菌、病毒及一些原生生物禽流感病毒SARS病毒大型真菌2）微生物生长繁殖产生的菌落沙门氏菌毛霉

向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？

应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。酸奶从社会中来

_____________，_______________________是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。防止杂菌污染获得纯净的微生物培养物♣实验室培养微生物条件1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件——培养基的配制2）确保其它微生物无法混入——无菌技术高压蒸汽灭菌固体培养基3）将需要的微生物分离出来——微生物的纯培养微生物在其表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。培养基的配制人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。011.培养基概念：2.培养基作用：3.培养基类型：固体培养基液体培养基半固体培养基划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分用途

培养基的类型及用途不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基天然培养基合成培养基鉴别培养基液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长半固体培养基：无动力有动力(弥散)固体培养基：菌落几种选择培养基加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌不加氮源的无氮培养基分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物伊红——美蓝培养基4.培养基的配方:（1）基本成分：水、碳源、氮源、无机盐。碳源无机碳源：有机碳源：氮源NH4＋、NO3-、NH3等。牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。CO2、CO32-、HCO3-。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。无机氮源：有机氮源：来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质无机盐Zn、Cu、Mn、Co、Mo等大量元素：微量元素：Ca、K、Mg等牛肉膏、蛋白胨：自养微生物异养微生物为什么培养基需要氮源？

是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。01培养基的配制01（2）特殊需求：满足微生物对

的需求。④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。例如：①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______；②培养霉菌时，需要将培养基调至_____；③培养细菌时，需要将培养基调至

；维生素酸性中性或弱碱性无氧表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000ml水pH、特殊营养物质、O201培养基的配制4.培养基的配方:牛肉膏蛋白胨1、下表为某培养基的配方,下列叙述正确的是()。

从物理性质看该培养基属于液体培养基该培养基中属于碳源的物质只有葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨该培养基缺少特殊营养物质该培养基调节合适的pH后就可以直接接种使用练习与应用2、下列可以作为自养型微生物氮源的是()。

A.N2、尿素B.牛肉膏、蛋白胨C.尿素、酵母粉D.铵盐、硝酸盐碳源、氮源、特殊营养物质碳源调节pH染色剂

获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染！（四）无菌技术1.概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。⑴消毒定义：使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。2.消毒与灭菌⑵灭菌的定义：

指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。

使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。（1）概念：（2）常用的消毒方法：（教材11页“资料卡”）①煮沸消毒：100℃煮沸5-6min。②巴氏消毒：针对一些不耐高温的液体；

62-65℃下处理30min或80-90℃下处理30s-1min。

③化学药剂消毒：用酒精擦拭双手、氯气消毒水源等。④紫外线消毒：用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。02无菌技术1.消毒

（1）概念：指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。（2）常用的灭菌方法：湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌

芽孢

芽孢是某些细菌（如芽孢杆菌属）在营养条件缺乏时，在菌体内形成的一个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体。

芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。

孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞，它是有丝分裂或减数分裂的产物。

02无菌技术2.灭菌孢子原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，基本保持培养基的营养成分不被破坏。对象：培养基等。注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。①湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121℃下维持15-30min。高压蒸汽灭菌锅（2）常用的灭菌方法：（教材11页“资料卡”）原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于

玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)

金属用具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170℃下加热2-3h。

③灼烧灭菌：酒精灯火焰充分燃烧层灼烧效果：最彻底原理：使微生物燃烧对象：接种工具如涂布器、接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位。（2）常用的灭菌方法：（教材11页“资料卡”）类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121℃,15～30min无菌的方法：接种室、接种箱，超净工作台♣两个方面：消毒:对操作的空间、操作者的衣着和手灭菌:培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶、吸管和接种环等♣还要注意：避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触；为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。02无菌技术超净工作台1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。旁栏思考消毒灭菌纯培养物：纯培养：培养物：将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体称为培养物。有单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。获得纯培养物的过程就是纯培养。配制培养基灭菌接种分离培养操作步骤：念珠菌显色培养基大肠杆菌培养基酵母菌培养基金黄色葡萄球菌和枯草杆菌培养基03微生物的纯培养分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。1.菌落：2.纯培养物：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。微生物群分散或稀释单个细胞单个菌落繁殖03微生物的纯培养♠酵母菌的纯培养3.原理：1．制备培养基配制培养基灭菌倒平板培养基灭菌：高压蒸汽灭菌——121℃，气压100kPa，15-30min培养皿灭菌：干热灭菌——160~170℃

，灭菌2h♠酵母菌的纯培养1）配制培养基称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml.2）灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min.将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h.倒平板待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板注意事项：①温度：50℃左右②操作：在酒精灯火焰附近③冷凝后平板倒置♠酵母菌的纯培养平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，①既可以防止培养基表面的水分挥发，②又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。♣平板划线法♠酵母菌的纯培养平板划线法和稀释涂布平板法。2.接种和分离酵母菌通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞

④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液

⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞

③试管口通过火焰

⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。♠酵母菌的纯培养第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌12345①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次②划线首尾不能相接③每次划线前接种环进行灭菌④划线后,培养皿倒置培养平板划线法注意事项:思考：若完成图示操作，共做了五次划线，接种环灼烧灭菌了几次？1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上原有微生物问题讨论完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。

警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水；离开实验室时一定要洗手，以

防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免

污染环境。作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染3.培养酵母菌♠酵母菌的纯培养结果分析与评价：1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？提示：在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。提示：如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。♠酵母菌的纯培养课堂随练1、纯化培养的实验基本步骤为:配制培养基→灭菌、倒平板→培养→观察请回答下列有关问题。(1)无论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的步骤是_________。(2)倒平板的适宜温度是50℃左右，原因是__________________________________。待平板冷凝后，要将平板倒置，这样既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止_________________________________。(3)划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_______________________________________________。(4)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及培养物必须经过______处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。调节PH温度过高会烫手，且易产生大量冷凝水，温度过低培养基又会凝固皿盖上的水珠落入培养基，造成干扰①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始灭菌

有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。评估论点的可信程度思维训练水果“酵素”是什么？其制作原理是什么？其中可能含有哪些成分？其是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？其中的所有成分都有益于人体健康吗？“酵素”就是“酶”的另一种说法。其制作是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。其中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分。不存在它独有的、特殊的营养物质。其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，此论点值得怀疑。课堂小结一、概念检测

1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。

（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（）（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。（）（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（）×√×练习与应用

2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？干制——降低食品的水分含量；腌制——通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温储存——通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。二、拓展应用

1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？练习与应用培养皿和培养基接种洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。

2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为210r/min，230r/min和250r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。二、拓展应用练习与应用（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？培养液中02含量不同。（2）从图中数据你可以得出什么结论?其原因是什么?培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定?这时候已经达到了环境容纳量。1.2.2微生物的选择培养和计数高压蒸汽灭菌液体培养基微生物的基本培养技术1、实验室培养微生物条件1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件—培养基2）确保其它微生物无法混入—无菌技术高压蒸汽灭菌温故知新：2、培养基的营养构成:碳源、氮源、水、无机盐等1）碳源：无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-有机碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物2）氮源：无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源3）无机盐：Ca、K、Mg为大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121℃,15～30min无菌的方法：接种室、接种箱，超净工作台课题背景自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群那么我们又如何达成这一目标呢？科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。二、微生物的选择培养和计数（一）选择培养基美国黄石国家公园的一个热泉

1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。

为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？

实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。培养基中加氨苄青霉素具有氨苄青霉素抗性的菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌培养基应有菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?举例13.选择培养基的类型类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温添加某种化学物质加入青霉素高浓度食盐特殊碳、氮源石油是唯一碳源营养缺陷不加碳源不加氮源水生栖热菌酵母菌、霉菌等真菌金黄色葡萄球菌能消除石油污染的微生物自养型微生物固氮菌加入青霉素：不加氮源：不加含碳有机物：——分离出酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)——分离出固氮菌——分离出自养型微生物补充资料1-几种选择培养基举例那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？思考-讨论选择培养基配方的设计尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。讨论：1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。见P18页培养基配方牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一培养基二讨论：1.从物理性质看两种培养基属于哪类？依据是什么？都属于固体培养基。依据是添加了凝固剂琼脂2.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？培养基二属于选择培养基；其可获得能分解尿素的微生物。3.两种培养基共同点，不同点？碳源、氮源、无机盐、水培养基一的碳源为_______，氮源为_______；培养基二的碳源为_______，氮源为_______；牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素（一）选择培养基疑难突破一：选择培养基配方的设计项目选择培养基鉴别培养基原理加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应用途培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物举例培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽)图示尿素分解菌大肠杆菌拓展延伸比较选择培养基与鉴别培养基牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml配方一：培养细菌配方二：培养可以分解尿素的细菌

补充资料2-普通培养基与选择培养基的比较1、从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？固体培养基选择培养基2、此培养基中共有哪些成分？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：配方二氮源：成分：碳源、氮源、水、无机盐（二）微生物的选择培养如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，可以如何操作？2、实验的具体操作：

1、稀释涂布平板法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。1.梯度稀释①铲取土样，将样品装入纸袋中1ⅹ101ⅹ1071ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL1mL1ⅹ105注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。90mL无菌水9mL无菌水1mL稀释涂布平板法操作过程③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。注意：各浓度分别涂布3个平板（重复实验）注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。2.涂布平板1071061031021041mL1mL1mL1mL9mL无菌水1mL1051.梯度稀释移液枪稀释涂布平板法操作过程1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中滴2、取少量稀释液（不超过0.1ml

），滴加到培养基表面灼3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。涂4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照浸4）取样涂布平板：主要方法稀释涂布平板法平板划线法主要步骤系列梯度稀释操作和涂布平板操作接种环在固体培养基表面连续划线接种工具涂布器接种环菌体获取从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体能否用于计数可以计数不能计数共同点都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征。知识归纳比较稀释涂布平板法和平板划线法（三）微生物的数量测定稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。1、原理：2、计数原则：一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。恒温培养箱稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照细菌一般选用104、105、106稀释倍数的菌液进行涂布培养。

待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。3.菌落培养稀释涂布平板法操作过程①稀释涂布平板法②显微镜直接计数法血细胞/细菌计数板——间接计数法——直接计数法03微生物的数量测定要求:①选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证

获得菌落数为30-300、适于计数的平板。②同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值；缺点:统计的菌落数往往比活菌的实际数目少统计的结果一般用菌落数而不是活菌数表示。①分离微生物②统计样品中活菌的数目原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。【原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。】如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。03微生物的数量测定

方法1：稀释涂布平板法

方法1：稀释涂布平板法？如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？每克样品中的菌落数＝(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。03微生物的数量测定间接计数法甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+100）/30.1×105=9×107个血细胞计数板：细菌计数板：缺点：①不能区分死菌和活菌→偏大②不适于对运动细菌的计数。③个体小的细菌在显微镜下难以观察。优点：快速、直观常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数对细菌等较小的细胞进行观察和计数；03微生物的数量测定

方法2：显微镜直接计数法直接计数法（“染色排除法”）显微镜直接计数：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数稀释涂布平板法显微镜直接计数法微生物的数量测定血细胞/细菌计数板——偏小(统计的菌落数比活菌的实际数目少)——活菌、死菌一起统计→偏大1071061031021041mL1mL1mL1mL9mL无菌水1mL105提出问题（1）如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。基础知识

绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。脲酶以尿素作为唯一氮源选择分解尿素CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2组分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0gH2O定容至1000mL

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数实验过程（1）土壤取样①取样地点要求：

细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。②取样过程：

铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。③注意事项：

取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后一定要洗手。（2）制备培养基①选择培养基：以尿素为唯一氮源。组分含量葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml②牛肉膏蛋白胨培养基：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：

提供无机盐；调节pH。

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数（3）样品的稀释与涂布平板

测细菌时，一般选用1×104、1×105、×106倍稀释的稀释液进行平板培养。

在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。②如何验证培养基中是否含有杂菌？设置2个平板作为对照：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数（4）微生物的培养与观察①培养条件：

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）②观察：

每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数微生物的培养和观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果

原因：防止因培养时间不足导致遗漏菌落数目一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。12345678时间/天数量45403530操作提示1.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。2.要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。3.本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。4.本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？

3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差