素材：基因工程教学中三个常见问题-高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程教学中三个常见问题进化论的观点让我们认识到自然界中现存的生物物种和类群是由古代的生物经过几十亿年的长期进化而逐渐形成的，各物种之间存在着不同程度的亲缘关系。根据生物分类规则，自然界中的生物分为原核生物和真核生物。由于原核生物在基因结构、转录催化酶类、RNA转录后加工、翻译过程及场所以及翻译后蛋白加工等方面都与真核生物存在显著差异，导致基因工程实际操作中目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、目的基因在受体细胞的表达及目的基因编码蛋白的活性等方面存在差异1.原核生物细菌的基因直接导入真核生物的受体细胞，或真核生物基因(如人的白细胞介素基因)导入原核生物大肠杆菌中能否表达获得重组蛋白的问题人教版高中生物学教材选择性必修3中，在基因工程部分开篇引用转基因抗虫棉案例，该案例是基于苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)基因导入受体棉花细胞，再经组织培养而成的基因工程产品。我们知道，无论原核生物还是真核生物，一个完整的基因包括启动子、编码区和终止子等组成部分，但真核生物与原核生物基因的启动子、编码区及终止子都存在结构差异，直接利用其本身的启动子无法在跨类的受体细胞中表达。这是因为原核基因的启动子的基本结构是－10区的共同序列TATA盒(Pribnowbox)和－35区的共同序列TTGACA(图1A)，该结构则是与原核生物转录催化酶RNA聚合酶的结构相适应的，原核生物典型的RNA聚合酶的结构包含2个ɑ亚基、1个β亚基、1个β'亚基和1个ω亚基，与启动子结合后还结合1个σ因子(图2A)。而真核生物基因典型的启动子包含了－25—－30区的TATAAA共同序列(Hognessbox)，－70—－80区的共同序列CCAAT(CAATbox)以及－80—－110区的富含GC的保守序列(GCbox)(图1B)，真核生物启动子结构与真核生物RNA聚合酶相适应，真核生物的RNA聚合酶有3类:RNA聚合酶I、RNA聚合酶II以及RNA聚合酶III。RNA聚合酶I主要负责rRNA的转录，RNA聚合酶II主要负责mRNA的转录(图2B)，而RNA聚合酶III主要催化tRNA的合成。真核生物每类RNA聚合酶都由8—16个亚基组成，结构与原核生物的RNA聚合酶有相似性，但都比原核生物RNA聚合酶复杂。因此，原核基因的表达需要受体细胞有原核生物的RNA聚合酶，真核基因表达需要受体细胞提供真核生物的RNA聚合酶。此外，真核生物的基因多数是断裂基因，即真核生物基因的编码区是由编码氨基酸的外显子和不编码氨基酸的内含子交替排列组成，转录产生的mRNA前体(核不均一RNA)需要进一步通过去除内含子、连接外显子、5'加上m7GpppNmNm“帽子”以及3'添加poly(A)“尾巴”，才能加工成为连续编码氨基酸序列的成熟mRNA。原核生物中没有这套核不均一RNA的加工系统。因此，利用原核基因本身的启动子和编码序列转化真核生物受体细胞，或者利用真核生物基因的启动子和基因序列转化原核生物受体细胞，目的基因在受体细胞中无法表达。基因工程实际操作时，在原核生物中表达，要利用原核生物的启动子或噬菌体的启动子(受体细胞提供噬菌体的RNA聚合酶)，在真核生物中表达目的基因时，应该利用真核生物或侵染真核生物病毒基因的启动子，当真核生物基因转化原核生物时，一般转化的是该基因的cDNA而不是含有内含子的原始基因。2.在进行基因表达载体的构建时，用于转化原核生物的表达载体上有RBS序列，而转化真核生物的载体一般没有该序列原核生物mRNA在起始密码子前7—12个核苷酸处有一个保守序列，该序列与核糖体小亚基中16SrRNA的3'端反向互补，是核糖体结合在mRNA上引起翻译起始所必需的，该序列称为SD序列(Shine-Dagarnosequence)或核糖体结合位点(RBS，ribosomebindingsite)。真核生物翻译的起始阶段，核糖体与mRNA的结合不依赖于mRNA1上存在的RBS，真核生物40S核糖体上有一种m7GpppNmNm“帽子”结合蛋白(eIF4E)，该蛋白专一性识别mRNA“帽子”结构，使核糖体40S小亚基与mRNA结合，经过真核生物翻译起始因子eIF3、eIF4G和poly(A)“尾巴”结合蛋白(PAB)而结合在3'poly(A)“尾巴”，最后通过大小亚基中rRNA的碱基配对，结合上60S的大亚基，引起翻译的起始。在基因工程实际操作中，转化原核生物的表达载体上通常在启动子和目的基因之间插入了RBS编码序列，这样目的基因在原核生物的受体细胞中转录后形成的mRNA可以顺利与核糖体结合，实现目的基因控制重组蛋白合成的效果。3.转基因的受体细胞从DNA、RNA和蛋白质水平进行检测，结果都显示是阳性，但在个体水平上却检测不到目的基因编码蛋白质的活性目的基因成功导入受体细胞后，基因会随着复制子的复制从亲代细胞传递给子代细胞，会通过转录产生mRNA，也会通过翻译产生目的基因编码的蛋白质。但是让受体细胞产生目的基因控制性状，翻译出的蛋白质必须具有生物学活性。重组蛋白在受体细胞翻译出来以后，若其未能成功折叠、未能切除非功能肽段或未能进行蛋白质翻译后的修饰等，则Westernblotting等方法能检测到重组蛋白的表达，却检测不到重组蛋白的活性。原核生物和真核生物都存在一些协助其他蛋白正确折叠成三级结构的分子伴侣，虽然部分蛋白质在缺少分子伴侣的条件下，依靠热力学会自发折叠成有活性的三级结构，但也有一些蛋白质的折叠必须依赖特异的分子伴侣。此外，真核细胞中存在复杂的蛋白质后加工系统，如蛋白质N末端Met和非必需肽段的去除，分子内二硫键的形成和部分氨基酸残基的糖基化、磷酸化、甲基化等修饰加工，而原核生物中这些蛋白质翻译后加工能力比较有限。很多真核生物或人类基因(如调节细胞增殖和免疫应答的细胞因子———白细胞介素6的cDNA)转化大肠杆菌后可以大量表达重组白细胞介素6，但由于缺少合适的分子伴侣，该蛋白主要是以无规则蛋白颗粒———包涵体的形式存在，在溶液中也不溶解，无法检测到其活性，需要在去垢剂存在下溶解包涵体，并经进一步复性才能获得有活性的蛋白。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，重组猪胰蛋白酶原在酵母中实现表达后，需要体外肠激酶切除部分C末端肽段后才能具有蛋白酶活性。促红细胞生成素(又称红细胞刺激因子或促红素)是一种人体内源性糖蛋白激素，可刺激红细胞生成，糖基对于稳定蛋白的结构和功能非常重要。促红细胞生成素的cDNA导入大肠杆菌能够实现表达，但由于大肠杆菌无法对重组促红细胞生成素进行糖基化修饰，导致获得的重组蛋白生物学活性很低，若该cDNA在真核细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)中表达，则获得的重组促红细胞生成素就显示明显的生物学活性。科学思维和科学探究意识的培养基因工程教学伴随着大量科学思维训练的内容，体现在基于证据得出结论，严谨缜密的思维过程，合乎逻辑的推理判断。基因工程是人类通过技术手段实现了控制性状基因的跨越物种、跨越生物