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ICS11.220B41
DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T4053—2020Real-timePCRassayforthedetectionofgenotypeVIInewcastlediseasevirus202007092020Real-timePCRassayforthedetectionofgenotypeVIInewcastlediseasevirus2020070920200809山东省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东省农业科学家禽研究所。本标准主要起草人:孟凯、吴家强、宋敏训、袁小远、张玉霞、杨金兴、艾武、王友令、亓丽红。新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法范围本标准规定了新城疫病毒基因VII型(NDV)荧光定量PCR检测方法。本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及脑、肺脏、脾脏等组织中新城疫病毒基因VII型的检测。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法剧减弱。随着PCR反应的进行,每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。4试剂或材料除非另有说明,在分析中仅使用分析纯的试剂,水为GB/T6682规定的一级水。10PBS:pH7.2RNA剧减弱。随着PCR反应的进行,每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。4试剂或材料除非另有说明,在分析中仅使用分析纯的试剂,水为GB/T6682规定的一级水。10PBS:pH7.2RNASYBRGreenIRT-PCRMLVRNaseInhibitor。DNA1.0×105拷贝/μLDEPC5仪器设备10μL、20μL、100μL、1000μL16000r/min。5.3PCR4.0℃~99.95.40.01g。5.5-205.6引物ForwardPrimer:5’-CAYGTCYGGAGGAAGGAGRCARAA-3’ReversePrimer:5’-GGATGTTGRCRGCATTCTKKT-3’注:Y=C或T;R=A或G;K=G或T样品棉拭子,剪刀,镊子,1.5mL离心管。3(2U/mL2mg/mL)10×PBS(pH7.2)1.5mL霉素10000U/mL+链霉素10mg/mL)的PBS中。7.2.2组织样品待检禽无菌采集脑、肺脏、脾脏等组织,装入一次性采样袋或其他灭菌容器,编号。h霉素10000U/mL+链霉素10mg/mL)的PBS中。7.2.2组织样品待检禽无菌采集脑、肺脏、脾脏等组织,装入一次性采样袋或其他灭菌容器,编号。h-20℃冰箱保存。/15m4500r/min离心10min1.5mL(:1P400r/min离心10min1.5mL8试验步骤8.1病毒RNA提取提取RNA时应避免RNA酶污染。同时设立阳性对照和阴性对照。用病毒RNA提取试剂盒,按照说明书步骤提取待检样品RNA,-80℃保存备用。8.2荧光定量PCR反应体系详见表1。表1荧光定量PCR反应体系试剂使用量酶混合物*0.4μLDNA聚合酶0.4μLSYBRGreenIRT-PCRBuffer**10μLPCRForwardPrimer(10μmol/L)0.4μLPCRReversePrimer(10μmol/L)0.4μLTotalRNA2.0μLDEPC水6.4μLTotal20μL每次均应设阴性对照。*内含MLV反转录酶和RNA酶抑制剂。8.3荧光定量PCR反应程序设定详见表2。表2荧光定量PCR反应程序设定9结果判定8.3荧光定量PCR反应程序设定详见表2。表2荧光定量PCR反应程序设定9结果判定阈值设定原则:根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。Ct(Cp)A.1)Ct(Cp)35,(A.2)阴性阶段1:反转录反应阶段2:PCR反应阶段3:溶解曲线分析42℃,15min95℃,5sec95℃,5sec95℃,10sec60℃,45sec(收集荧光)65℃,5sec1Cycle40Cycle95℃,5sec无Ct(或Cp)值并且无扩增曲线,表明样品中无基因VII型新城疫病毒核酸。阳性83.5VII(A.3)Ct(或Cp)值>35的样品须复检,重做结果无Ct值者为阴性,否则为阳性。/r/
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