DB37-T 4044-2020 禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法-（高清版）

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DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T4044—2020禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法Real-timePCRassayforthedetectionoffowladenovirusserotype420202020070920200809山东省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学家禽研究所。本标准主要起草人：孟凯、吴家强、袁小远、宋敏训、张玉霞、杨金兴、艾武、亓丽红。禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法范围（FAdV-4）PCRFAdV-4GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。4试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T6682规定的一级水。10PBS：pH7.2DNA剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。4试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T6682规定的一级水。10PBS：pH7.2DNASYBRGreenIqPCR1.0×105拷贝/μLDEPC5仪器设备10μL、20μL、100μL、1000μL16000r/min。0.01g。5.4PCR4.0℃～99.95.5-205.6引物P1：5’-GTCTATACCAACACGAGCACC-3’P2：5’-TTTTGTACCCGTCGCAGAG-3’样品棉拭子，剪刀，镊子，1.5mL离心管。3（2U/mL2mg/mL）10×PBS（pH7.2）1.5mL（青10000U/mL10mg/mL）PBS待检禽无菌采集整个肝脏，装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。h-20℃冰箱保存。/15m4500r/min离心10min1.5mL将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（1：5～10）加入灭菌PBS进行充分研磨，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清液转入新的1.5mL离心管中，编号备用。8试验步骤DNA用病毒DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待检样品的DNA。病毒DNA提取成功后置于-20℃保存备用。PCR详见表1。表1荧光定量PCR反应体系试剂使用量SYBRGreenIqPCR混合物*10μLPCRForwardPrimer(10μmol/L)1μLPCRReversePrimer(10μmol/L)1μLDNA模板2μLDEPC水6μLTotal20μL每次均应设阴性对照。*内含DNA聚合酶，dNTPMixture，Mg2+和荧光染料SYBRGreen。8.3荧光定量PCR反应程序设定详见表2。表2荧光定量PCR反应程序设定阶段1：预变形阶段2：PCR反应阶段3：溶解曲线分析95℃，1min95℃，5sec95℃，5sec60℃，45sec（收集荧光）65℃，5sec1Cycle40Cycle95℃，5sec9结果判定9结果判定阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。Ct（Cp）A.1）Ct（Cp）35，（A.2）阴性无Ct（或Cp）值并且无扩增曲线，表明样品中无FAdV-4。阳性C（Cp35Tm8FAd4.9.3.3有效原则Ct（或Cp）值＞35的样品须复检，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。附录A（资料性附录）/