DB37-T 3801-2019 花生品种纯度鉴定技术规程-SSR标记法-（高清版）

ICS 65.020.01B05

DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T3801—2019花生品种纯度鉴定技术规程—SSR标记法SSRmarkers2019SSRmarkers2019122420200124山东省市场监督管理局发布目 次前言 II112范引文件 13语定义 1425器备 2627液制 28物息 29作骤 2样准备 2PCR扩增 3PCR产检测 310PCR扩增 3PCR产检测 310定法原则 4判方法 4判原则 4附录A（范附）溶液制 5附录B（料附）推荐物 7附录C（料附）参照种单 9前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化委员会归口。本标准起草单位：山东省花生研究所。本标准主要起草人：单世华、闫彩霞、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。花生品种纯度鉴定技术规程-SSR标记法范围（SipleseqenceepeatSSR（ArchihypgaL.）本标准适用于试验样品为种子的花生品种的纯度鉴定。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本文件。3.1品种纯度Varietypurity品种在SSR标记带型上典型一致的程度，反映鉴定品种的特征特性。3.2简单重复序列Simplesequencerepeat（SSR）（1～6个3.3推荐引物Recommendedprimer根据最少引物区分最多品种的原则，筛选出多态性高，条带清晰、重复性好的一套SSR引物。3.4参照品种Referencevariety具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。原理PCR（105℃～1360.22MPa）（400）；高15000（0℃～100（190nm～1100（～99℃（0rpm～230（120℃（0.01g）；1.0mm）；（0r/min～2500r/min，室温～100）（-2.00～20.000pH）；（2µl、10、100µl、200µl、500µl和1000试剂乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）；三羟基甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十六烷基三（TEMED）（APS）（AgNO3）；6×loadingbuffer；GoldViewNAa（10ugL-1（25:2412FreenMix；SSR（10μmol•L-1）；20bpDNALadderGB/T6682相关溶液配制方法见附录A。推荐引物的序列信息与等位变异见附录B。GB/T3543.210010C）各2DNADNA取单株幼苗的根、茎、叶等器官50mg，放入1.5mL离心管中，液氮研磨。CTAB法提取基因组DNA，加入100µl1×TE（pH8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5µlRNAase，37℃温育1h，－20℃保存留用。DNA测定DNA溶液的OD260/OD280值，确保在1.7～2.0范围内。测定其OD260的吸光度，以1个OD260值相当于50mg•L-1DNA浓度来计算纯化DNA的浓度。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，GoldView染料进行染色。稀释至工作浓度为30ng•μL-1，置于4℃备用。PCR总体系为10μL，包括1.5μLDNA，1.9μL水，5μL2×FrementsMix，0.8μLF/R引物，混匀。95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃保存备用。PCR9.4.1.2灌胶7.5mL637mL9.4.1.2灌胶7.5mL637mL500μL10%APS及20μLTEMED，0.8cm将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入1×TBE缓冲液，至下槽液面约为槽高的1/3，上槽液面高于凹板玻璃面约1cm。拔去梳子，冲洗胶孔，赶走底层气泡和杂质。上样在10μLPCR产物中加入2μL6×loadingbuffer，用微量移液器上样，每孔加入2μLPCR扩增产物；同时，在两侧样品孔中加入20bpDNALadder分子量标记。电泳2002/32水洗电泳结束后，分开两块玻璃板取出凝胶，用水漂洗10s～20s，重复2次。银染转移至400mL0.1%AgNO3溶液中，在摇床上轻摇10min。水洗从染色液中取出，在水中快速漂洗2次，时长8s～10s。显影转移至400mL显色液中，在摇床上轻摇至带纹清晰，用水冲洗至溶液澄清。成像将凝胶置于凝胶成像工作台，选用透射UV光，调节focus至图像最清晰，保存。数的百分率表示纯度，计算公式如式1：数的百分率表示纯度，计算公式如式1：数100% (1)检测样品种子粒数10.2判定原则1002AA附录A（规范性附录）溶液配制DNA1mol•L-1NaOH4gNaOH，加水定容至100mL。1mol•L-1Tris-Cl（pH8.0）溶液称取121.1gTris，加水定容至1L，浓盐酸调至pH8.0，高压灭菌备用。0.5mol•L-1EDTA（pH8.0）溶液2称取186.1gEDTA-Na，800mL1L，1mol•L-1NaOHpH8.0，21×TE1mL1mol•L-1Tris-HCl（pH8.0），0.2mL0.5mol•L-1EDTA（pH8.0），加水定容至100mL。A.1.5A.1.5DNA4CTAB，16.364NaCl，20mL1mol•L-1Tris-Cl（pH8.0），8mL0.5mol•L-1EDTA（pH8.0），200mL，465A.2聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂70700mL无水乙醇，加水定容至1L。10×TBE分别称取108g三羟基氨基甲烷，55g硼酸，加入800mL水加热溶解，再加入0.5mol•L-1EDTA（pH8.0）溶液37mL，加水定容至1L。1×TBE100mL10×TBE，加水定容至1L。10%APS0.5gAPS溶于5mL水中。A.2.56（29:1）58gg100mL10×TBE1L，4染色液称取1g硝酸银，加水定容至1L。显色液6gNaOH，0.2g四硼酸钠，1.6mL甲醛，加水定容至400mL。BB附录B（资料性附录）推荐引物B.1推荐引物见表B.1。表B.1推荐引物序号引物连锁群引物序列（5′→3′）常见等位变异bp参照品种8GM1996B03F-catcccatcattttccctcttR-tacagtgaaggtgggatcctg77zh.h503477/92zh.h247785zh.h532787zh.h139589zh.h276492zh.h24059GM2638A04F-atgctctcagttcttgcctgaR-cagacataacagtcagtttcacc45zh.h168955zh.h270257zh.h238463zh.h474965zh.h532769zh.h225069/73zh.h184373zh.h094910GNB317未定位F-gaaaagcttgcaaaatcgagaR-tccttccatgttggtgaatg188zh.h2550194zh.h0540197zh.h2561200zh.h2405203zh.h2764212zh.h5034224zh.h2462227zh.h0537230zh.h474911GNB357未定位F-aggtttgctttgggatgatgR-ccgataaaaccaggcaagaa191zh.h5034191/203zh.h0436194zh.h1602197zh.h2406203zh.h0537215zh.h0861218zh.h1331表B.1推荐引物（续）序号引物连锁群引物序列（5′→3′）常见等位变异bp参照品种12GNB556A01F-tcagggtgggttaccaacatR-taatccacattgaaccgacg56zh.h052556/71zh.h532762zh.h093468zh.h241371zh.h241077zh.h086880zh.h223186zh.h133113PM308未定位F-ccttcttctttctcctcctcaR-caattcgtgatagtattttattggaca64zh.h503474zh.h474978zh.h097780zh.h276482zh.h246486zh.h240592zh.h068014pPGPseq2C11A03F-tgacctcaattttggggaagR-gccactattcatcgcggta385zh.h2456403zh.h2764418zh.h4749439zh.h2405450zh.h2406461zh.h043615pPGSseq19D6B05F-tttgttatgctcacaccccaR-aaaaatgaagcaatattttgttgttag180zh.h4779180/192zh.h5327192zh.h2406192/204zh.h2152200zh.h2508204zh.h0537210zh.h5034CC附录C（资料性附录）参照品种名单C.1参照品种名单见表C.1表C.1参照品种名单序号种质库统一编号品种名称序号种质库统一编号品种名称1zh.h0099赣榆小站秧38zh.h2292浒山半旱种2zh.h0102启东赤豆花生39zh.h2330全州凤凰花生3zh.h0125涡阳站秧40zh.h2384英德白沙鸡豆仔4zh.h0436蒲庙花生41zh.h2405试花1号5zh.h0477睦屋拔豆42zh.h2406试花3号6zh.h0525锦交1号43zh.h2410博山站秧子7zh.h0531滕县滕子花生44zh.h2413沂南小麻叶8zh.h0537巨野小花生45zh.h2425嘉祥长秧9zh.h0540栖霞爬蔓小花生46zh.h2426沂南大铺秧10zh.h0678托克逊小花生47zh.h2456郑72-511zh.h0680北京大粒墩48zh.h2461长垣一把抓12zh.h0764昆嵛大粒墩49zh.h2462濮阳83713zh.h0861反修1号50zh.h2464濮阳二糙14zh.h0868栖霞半糠皮51zh.h2466王屋花生15zh.h0930莱芜蔓52zh.h2477开封大拖秧16zh.h0934夏津小二秧53zh.h2499南江大花生17zh.h0949牟平大粒蔓54zh.h2508南溪二郎子18zh.h0977汶上蔓生55zh.h2550霸王鞭19zh.h1315发财生56zh.h2561潜山大果20zh.h1331柳城筛豆57zh.h2562宿松土花生21zh.h1377北镇大花生58zh.h2591邵东中扯子22zh.h1395花3359zh.h2608大埔种23zh.h1585洪洞花生60zh.h2682/