DB37-T 3630-2019小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法-（高清版）

ICS 65.020.01B16

DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T3630—2019小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法MoleculardetectionmethodsofTilletiafoetida&Tilletiacaries20192019072320190823山东省市场监督管理局发布目 次前言 II范围 1术和义 1仪设备 1主试剂 1分检测 1麦子小普腥黑病冬子组DNA1瘿冬子组DNA2物列 2PCR2泳测 2测果断 3样保存 3档样保存 3档保存 3前 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省植物保护总站、山东农业大学。小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法范围本标准规定了小麦普通腥黑穗病菌的分子检测方法。本标准适用于小麦普通腥黑穗病菌的分子检测。下列术语和定义适用于本文件。2.1小麦普通腥黑穗病菌Tilletiafoetida&Tilletiacaries指引起小麦普通腥黑穗病的病原菌统称，包括小麦光腥黑穗病菌（Tilletiafoetida）和小麦网腥黑穗病菌（Tilletiacaries）两种。2.2小麦普通腥黑穗病菌分子检测MoleculardetectionofTilletiafoetida&Tilletiacaries（Tilletia（Tilletia的ITSPCR摇床、显微镜、普通离心机、电热恒温水浴锅、移液器、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、锥形瓶、离心管、盖玻片、载玻片、电子天平等。除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯。CTABTrisTEPCRdNTPsTaqDNADNAmarker、1×TAEDNALoading3mol/LNaOH溶液、1mol/LHClDNA50g250mL100mL3200rpm5min10min100mL，8000rpm10min，弃上清，留沉淀。1.5mL2mL10000rpm5min1mL100mL22mL000rpm2min，加入1mL3mol/L的NaOH6530min1mol/LHCl10000rpm2min4700μL65CTAB，651h15minTris（25∶24∶1）2次～310000rpm102ml（24∶1）2～310000rpm10min1.5mL2030min。12000rpm15min1mL70，12000rpm5min212000rpm30s15min。30～50μLTEDNA。注：也可采用经验证等效的该DNA2mLCTAB2mLCTAB（详见5.1.5～5.1.14）DNA。所用引物序列如下：XHS-F：5’-CTTTATTGCCGTACTTCTCTTCG-3’XHS-R：5’-GCAACCTTCTCTTTCAAAAAG-3’预期的扩增片段大小为409bp。PCR反应体系（25µL）：无菌ddH2O18µL，10×PCR缓冲液r2.5µL，dNTPs(2.5mmol/L)2µL，引物（20μmol/L）各0.5µL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5µL，模板DNA1µL。945min；9430s，55℃退火30s，721min，355min。5µLPCR1的61.2V409bp（图1）注：M：DNAmarkerDL2000；1：小麦腥黑穗病菌的特异性片段；2：阴性对照。图1小麦普通腥黑穗病菌的PCR扩增5.6检测结果判断检测验证；如果样品所有重复扩增后，电泳检测均无特异性条带出现，则判定所检测样品结果为阴性。6结果判定样品经PCR检测确定为阳性的，即判定为该样品带有小麦普通腥黑穗病菌。检测验证；如果样品所有重复扩增后，电泳检测均无特异性条带出现，则判定所检测样品结果为阴性。6结果判定样品经PCR检测确定为阳性的，即判定为该样品带有小麦普通腥黑穗病菌。7样品保存