DB37-T 4363-2021 伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光PCR检测方法

ICS11.220CCSB41ICS11.220CCSB41山 东 省 地 方 标 准DB37/T4363—2021检测方法Duplexreal-timePCRdetectionmethodforpseudorabiesvirusandminkDuplexreal-timePCRdetectionmethodforpseudorabiesvirusandminkenteritisvirus2021031120210411山东省市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。伪狂犬病毒与水貂肠炎病毒双重荧光PCR检测方法范围（）PCR（GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫本文件没有需要界定的术语和定义。本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PCRDNAPBS5试剂或材料GB/T6682A.52～8KA.6RNAA.75.675A.8，-20氯仿，44TEA.9gBVP2PCR（）13000r/min6.3冰箱，2～8205μL、10μL、100μL1000μL。1.5mL样品121℃，15min——棉拭子；——剪刀、镊子；1.5mL——研钵或组织研磨仪。有咽喉拭子样品和肛门拭子样品：3～51.0mLPBS1.5mL肛门拭子采样，采样时将拭子深入肛门转一圈并沾取少量粪便；然后将拭子插入装有1.0PBS1.5mLh302.010mLPBS000r/min离心15min1.5mL或者用专用仪器设备处理待检组织样品。2～82470（冻融不超过三次）。荧光PCR检测方法的实验室规范应符合GB19489和GB/T27401要求。样品病毒核酸DNA1.5mL2001.0mLDNAμLK210μLRNA1h200μL10min413000r/min15min（10min413000r/min15min1.0mL7548000r/min、10min5min50μLTEDNA，-20DNADNAPCRPCR+1+2μL荧光PCR反应液。按B.2配制反应液，为避免移液器取样损失，建议按n+1个反应配PCR20μL，加样PCR8.2.7DNA5500r/min离心PCRPCRPCRPCR94/3℃/15℃/60sec共40402min60PCRFAMCy5CtCt28。注：Ct阴性双检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无伪狂犬、水貂细小病毒核酸。阳性CtCy5Ct30.0FAMCt9.3.3可疑Cy5Ct30.0FAMCt9.3.3可疑Ct30.0～38.0 附录A（0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)称取6.055gTris置于100mL80mLHCl调节pH8.0，定容至100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液称取18.61gNa2EDTA·2H2O置于100mL80mL10NaOHpH8.0，100mL10%SDS称取10gSDS80mL100mL5mol/LNaCl称取29.25gNaCl80mL100mL定容至100mL。20mg/mLK0.210mL，20RNA将1定容至100mL。20mg/mLK0.210mL，20RNA将1RNA酶溶于6mL1001510-2075量取75mL25mLTE将0.5mL10mmolTris-HCl(pH8.0)、0.1mL的0.5mol/LEDTA(pH8.0pH8.0，加ddH2O50mL，4附录B（资料性）引物探针序列及荧光PCR反应液配方引物和探针序列表见表B.1。表B.1引物和探针序列表病毒名称序列名称序列伪狂犬病毒上游引物GCCAACCCGCTCGTGCTC下游引物CACGAACACGCAGTCGCAGTA探针FAM-GGCAGGTGCTGGGACTCGGGC-BHQ1水貂肠炎病毒上游引物CGTCTACACAAGGGCCATTTA下游引物CCATGTTGTCTACCAAATGCAT探针Cy5-CGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCA-BHQ3PCR表B.2表B.2PCR注：Taq酶，TaqDNA聚合酶。组分1个检测体系的加入量5×PCR缓冲液5.0μLTaq酶(5U/μL)0.5μLdNTPs(10mmol/L)1.0μLMgCl2(25mmol/L)3.0μL伪狂犬病毒上游引物(10μmol/L)0.5μL伪狂犬病毒下游引物(10μmol/L)0.5μL伪狂犬病毒探针(10μmol/L)0.5μL水貂肠炎病毒上游引物(10μmol/L)0.5μL水貂肠炎病毒下游引物(10μmol/L)0.5μL水貂肠炎病毒探针(10μmol/L)0.5μLdd