第四章基因工程的主要技术及其原理课件1

第四章基因工程的主要技术及其原理第四章基因工程的主要技术及其原理1第四章基因工程的主要技术及其原理

第一节DNA和RNA的提取和纯化

第二节凝胶电泳

第三节核酸和蛋白质的分子杂交

第四节聚合酶链式反应技术

第五节DNA序列分析

第六节基因定点诱变

第七节DNA与蛋白质互作分析

第四章基因工程的主要技术及其原理第一节

DNA和RNA的提取和纯化

核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。第一节

DNA和RNA的提取和纯化核酸是遗传信息第一节

DNA和RNA的提取和纯化核酸提取与纯化的原则保持核酸分子一级结构的完整性温度不要过高控制一定的pH值范围(pH值5-9)

保持一定的离子强度减少物理因素对核酸降解的机械剪切力防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。第一节

DNA和RNA的提取和纯化核酸提取与纯化的原则第一节

DNA和RNA的提取和纯化DNA酶抑制剂

金属离子螯合剂：

DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；

阴离子型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。第一节

DNA和RNA的提取和纯化DNA酶抑制剂第一节

DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAase)抑制剂

RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。

皂土（bentonite

）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。

肝素

复合硅酸盐（Macaloid)

RNase阻抑蛋白（RNasin）

氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)第一节

DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAas第一节

DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAase)抑制剂

DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：

DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。剧毒。第一节

DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAase)第一节DNA和RNA的提取和纯化一般程序

1、供体的核酸分离

供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA分离细胞器分离总RNA

分离细胞器DNARNApoly(A)RNA特异性RNA

染色体DNA(组建基因组文库)第一节DNA和RNA的提取和纯化一般程序一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取的几种方法

基因组DNA的提取

CTAB法

SDS法其它

非基因组DNA的提取

质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取的几种方法一、DNA提取的基本原理与方法

基因组DNA-CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-CTAB法原一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的经典配方

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl

提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的经典配方一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的改进配方

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的改进配方一、DNA提取的基本原理与方法CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液一、DNA提取的基本原理与方法CTAB法流程图植物材料裂解一、DNA提取的基本原理与方法

基因组DNA-

SDS法原理

SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

SDS法DNA提取缓冲液组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-SDS法原理一、DNA提取的基本原理与方法SDS法流程图（以动物组织为例）

动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液一、DNA提取的基本原理与方法SDS法流程图（以动物组织为例一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法

根据细胞裂解方式的不同有：

物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法

化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法

生物方式：酶法一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法

根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法硅质材料:高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。

阴离子交换树脂:低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。

磁珠:磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法

根据核酸分离纯化方式的不同有：浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法一、DNA提取的基本原理与方法

质粒DNA－碱裂解法碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法一、DNA提取的基本原理与方法

质粒DNA－碱裂解法对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液碱裂解法流程图一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法对数期一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法(溶液配方)SolutionⅠ

50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)、10mmol/LEDTA(pH8.0)

高压灭菌后，4℃保存备用。

SolutionⅡ(现用现配制)

0.2mol/LNaOH、1%SDS

SolutionⅢ（100ml）

5mol/LKAc60ml、冰醋酸11.5ml、水28.5ml

配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸（pH4.8）。一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法(溶液配方一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法

所用试剂的生化作用溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,同时有利于溶菌酶的作用。一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法

所用试剂的生化作用

NaOH-SDS液:NaOH浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为R一O－S03-…R+一蛋白质的复合物,使蛋白质变性沉淀下来。一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法

所用试剂的生化作用

KAc:pH4.8的KAc溶液是为了把pHl2.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。高盐3mol/LKAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体DNA因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法

所用试剂的生化作用

无水乙醇:沉淀DNA，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

酚-氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法

所用试剂的生化作用异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法一、DNA提取的基本原理与方法

质粒DNA－煮沸法

原理：染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－煮沸法一、DNA提取的基本原理与方法

细胞器DNA－差速离心法线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。一、DNA提取的基本原理与方法细胞器DNA－差速离心法一、DNA提取的基本原理与方法I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中DNA提取的基本步骤一、DNA提取的基本原理与方法I.材料准备DNA提取的基本步一、DNA提取的基本原理与方法最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料准备一、DNA提取的基本原理与方法最好使用新鲜材料，低温保存的样一、DNA提取的基本原理与方法

细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－液氮研磨动物组织－匀浆或液氮研磨组培细胞－蛋白酶K

细菌－溶菌酶破壁酵母－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁一、DNA提取的基本原理与方法细胞裂解材料应适量，过多会一、DNA提取的基本原理与方法

核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取一、DNA提取的基本原理与方法核酸分离、纯化采用吸附材料一、DNA提取的基本原理与方法

核酸分离、纯化

蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理一、DNA提取的基本原理与方法核酸分离、纯化一、DNA提取的基本原理与方法

核酸分离、纯化多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。一、DNA提取的基本原理与方法核酸分离、纯化一、DNA提取的基本原理与方法

核酸分离、纯化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合

盐离子的去除：

70％的乙醇洗涤一、DNA提取的基本原理与方法核酸分离、纯化一、DNA提取的基本原理与方法

核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解基因组DNA的提取质粒DNA的提取一、DNA提取的基本原理与方法核酸沉淀、溶解当沉淀时间有一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取常见问题DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）问题1：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因对策一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取常见问题DNA中含有一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取常见问题材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融

问题2：DNA降解。对策

原因一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取常见问题材料不新鲜或一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题3：DNA提取量少。对策

原因一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取常见问题实验材料不佳二、RNA提取的基本原理与方法

制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用

1)

RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(0~65℃均具活性）；抗变性剂

2)

解决办法：

外源RNase—高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套

内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等二、RNA提取的基本原理与方法制备RNA的关键—防止内二、RNA提取的基本原理与方法

总RNA的提取根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：

1）热苯酚抽提法

2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍

3）LiCl/尿素法其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。二、RNA提取的基本原理与方法总RNA的提取二、RNA提取的基本原理与方法

RNA提取的通用方法

异硫氰酸胍/苯酚法原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取的通用方法二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取的通用方法

异硫氰酸胍/苯酚法

步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70％乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取的通用方法二、RNA提取的基本原理与方法

影响RNA提取的因素材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，－70℃短期保存二、RNA提取的基本原理与方法影响RNA提取的因素二、RNA提取的基本原理与方法影响RNA提取的因素

样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量二、RNA提取的基本原理与方法影响RNA提取的因素二、RNA提取的基本原理与方法影响RNA提取的因素纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。二、RNA提取的基本原理与方法影响RNA提取的因素二、RNA提取的基本原理与方法

RNA提取常见问题

RNA的降解

OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题

RNA的降解新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题

RNA的降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题

OD260/OD280

比值偏低

蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。

苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题

OD260/OD280

比值偏低

抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。

设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。

用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题电泳带型异常非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。

变性电泳条带变淡：

EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题下游实验效果不佳

RNA降解

抽提试剂的残留

75%乙醇洗涤

样品中杂质的残留

多糖等杂质，再次沉淀

DNA污染

使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNA二、RNA提取的基本原理与方法RNA提取常见问题二、RNA提取的基本原理与方法RT常见问题分析和解决方案可能原因解决方案RNA降解分离无污染，高质量的RNA；防止RNA降解RNA中含逆转录酶抑制剂70％（v/v）乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制剂起始RNA量太低增加RNA的量多糖同RNA共沉淀用氯化锂沉淀RNA以除去多糖合成cDNA第一链合成的引物退火失败确定退火温度适合所用的引物RNA模板存在较多二级结构将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，提高逆转录反应温度反转录成功，PCR失败PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物问题1：少量或没有RT-PCR产物二、RNA提取的基本原理与方法RT常见问题分析和解决方案可能三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定

1.紫外分光光度法原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值,OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8。当OD260/OD280大于1.8则可能有RNA污染。当OD260/OD280小于1.8时则有蛋白质污染。

在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40ug/ml。三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定1.紫外分光光度法

测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。

1)OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。

2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；

3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定1三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定1.紫外分光光度法测RNA

纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。

1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；

2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；

3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定1三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定2.定磷法先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝（660nm），通过测定磷含量计算出核酸含量

3.定糖法当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚(地衣酚)反应呈鲜绿色（670nm），反应需要三氯化铁作催化剂

DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595nm处

三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定

4.EB荧光分析法

EB荧光染料能插入DNA或RNA的碱基对平面之间并结合在上面，在紫外光的激发下产生桔黄色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB的量与DNA分子长度和数量成正比，则荧光强度可以表示DNA量的多少。将标准DNA溶液按浓度由低到高分别与同样体积的EB溶液混匀在一块黑色的点样板上形成一个浓度梯度，然后将待测DNA也与同样体积的溴化乙锭混匀，最后将待测样品与标准品在紫外灯下发出的荧光强度进行比较，就能测出该样品总DNA浓度。三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定核酸的保存

对DNA

保存：①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②长期保存样品中可加入1滴氯仿。

对RNA

保存：①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。三、DNA/RNA浓度、纯度和相对分子

质量的测定核第二节

凝胶电泳

一、琼脂糖凝胶电泳

二、琼脂糖变性胶电泳

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

四、脉冲电场凝胶电泳

五、凝胶电泳中DNA的检测

第二节

凝胶电泳一、琼脂糖一、琼脂糖凝胶电泳

电泳的基本原理一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度越快,反之则较慢。电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。

一、琼脂糖凝胶电泳电泳的基本原理一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳

电泳的基本原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同。一、琼脂糖凝胶电泳电泳的基本原理一、琼脂糖凝胶电泳

电泳的基本原理在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的酶切后与已知相对分子质量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的相对分子质量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。

一、琼脂糖凝胶电泳电泳的基本原理一、琼脂糖凝胶电泳

电泳的基本原理在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋(SC)的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状(L)分子。这3种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA时，在琼脂糖凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。一、琼脂糖凝胶电泳电泳的基本原理一、琼脂糖凝胶电泳Relaxed

supercoiled

Increasingdegreeofsupercoiling

相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。一、琼脂糖凝胶电泳RelaxedsupercoiledI一、琼脂糖凝胶电泳

电泳的基本原理另外在制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，只需要5～10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.01～0.1μg的DNA。一、琼脂糖凝胶电泳电泳的基本原理一、琼脂糖凝胶电泳

一、琼脂糖凝胶电泳第四章基因工程的主要技术及其原理课件1一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖凝胶：琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。

琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高空隙小一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多一、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶的分辨力

空隙大小决定其分辨分子大小的能力。

空隙小，分辨率高：

小分子较易通过，而大分子难通过；

空隙大，分辨率低：

大小分子几乎以同等速率通过。一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的分辨力一、琼脂糖凝胶电泳

上样缓冲液：上样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。

上样缓冲液有三个作用：

1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；

2）使样品带有颜色便于简化上样过程；

3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。一、琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液：一、琼脂糖凝胶电泳类型6×缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝室温0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚蓝4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚蓝4℃40%(m/V)蔗糖水溶液6×凝胶上样缓冲液一、琼脂糖凝胶电泳类型6×缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝一、琼脂糖凝胶电泳

染色

主要有溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。然后，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。一、琼脂糖凝胶电泳染色一、琼脂糖凝胶电泳染色-凝胶的EB染色注意事项EB被认为是一种强致癌物质EB可用来检测单链或双链核酸EB使用时的配制、贮存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5μg/ml。当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。一、琼脂糖凝胶电泳染色-凝胶的EB染色一、琼脂糖凝胶电泳

染色-凝胶SYBRGold的染色

SYBRGold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。一、琼脂糖凝胶电泳染色-凝胶SYBRGold的染色一、琼脂糖凝胶电泳影响电泳迁移的主要因素DNA的大小：双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比DNA的构象：一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。琼脂糖浓度：浓度越低，相同核酸分子迁移越快凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。一、琼脂糖凝胶电泳影响电泳迁移的主要因素一、琼脂糖凝胶电泳影响电泳迁移的主要因素所用的电压：低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；一、琼脂糖凝胶电泳影响电泳迁移的主要因素一、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖类型凝结温度/℃熔化温度/℃

标准琼脂糖35~3890~95不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异40~4285~90

高强度琼脂糖34~4385~95

修饰的低熔点/凝点琼脂糖25~3563~653565

超低熔点8~1540~45

低黏性低熔点琼脂糖25~307038853075不同类型琼脂糖的性质一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖类型凝结温度/℃熔化温度/℃标一、琼脂糖凝胶电泳浓度（%）标准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.1不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围一、琼脂糖凝胶电泳浓度（%）标准高强度低熔点低黏度低溶一、琼脂糖凝胶电泳

影响电泳迁移的主要因素电泳缓冲液：常用的有TAE、TPE及TBE

三者相比：

1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；

2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；

3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；

4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。一、琼脂糖凝胶电泳影响电泳迁移的主要因素一、琼脂糖凝胶电泳影响电泳迁移的主要因素不同构像质粒一、琼脂糖凝胶电泳影响电泳迁移的主要因素不同构像质粒一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳紫外线光源灵敏度:302nm>254nm>366nm一、琼脂糖凝胶电泳紫外线光源灵敏度:一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳二、琼脂糖变性胶电泳

二、琼脂糖变性胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE

聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N′-甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯酰胺的单体形成长链，由N，N′-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。

丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为71.08，为中枢神经毒物。N，N’-甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无味，分子量为154.17，亦为中枢神经毒物。1%的稀溶液与皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的确切致死量（LD50）为170mg/㎏，所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接触和吸入粉尘。聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性条件下可产生自由基，而增速剂N，N，N′，N′-四甲基乙二铵（TEMED）可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成，从而加速聚合。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳种类变性聚丙烯酰胺凝胶：用于单链DNA片段的分离或纯化。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。非变性聚丙烯酰胺凝胶：用于双链DNA片段的分离和纯化。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。用途：制备高纯度的DNA片段。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳种类三、聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围（bp）二甲苯氰FF溴酚蓝3.51000~20004601005.080~500260658.060~4001604512.040~200702015.025~150601520.06~1004512注:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围三、聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围二甲苯氰三、聚丙烯酰胺凝胶电泳SSCPSNPDNA测序蛋白质分离175kD

83

654517聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果三、聚丙烯酰胺凝胶电泳SSCP175kD聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳分离蛋白质(补充）

2-DGelElectrophoresis第一向IEF:IsoelectricFocusing等电聚焦区分带不同电荷的分子三、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳分离蛋白质(补三、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳分离蛋白质(补充）第二向：SDS

分离不同分子量蛋白质三、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳分离蛋白质(补四、脉冲电场凝胶电泳

pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE

为何选PFGE？超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但PEGE解决了这一问题。四、脉冲电场凝胶电泳pulsed-fieldgel四、脉冲电场凝胶电泳PFGE工作的基本原理这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。四、脉冲电场凝胶电泳PFGE工作的基本原理四、脉冲电场凝胶电泳B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图四、脉冲电场凝胶电泳B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图四、脉冲电场凝胶电泳PEGE类型垂直脉冲场电泳系统(verticalpulsedfield)

场翻转系统(fieldinversion)

旋转胶系统(rotatinggel)

箝位匀强电场系统(contour-clampedhomogeneouselectricfield)四、脉冲电场凝胶电泳PEGE类型四、脉冲电场凝胶电泳A-+AB-+B垂直或横向交变系统场翻转系统箝位匀强电场系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+四、脉冲电场凝胶电泳A-+AB-+B垂直或横向交变系统场翻转四、脉冲电场凝胶电泳影响分辨率的因素脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。电场夹角：电场方向的夹角常为1100-1200，研究证实900夹角也非常有效的。温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4℃进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。四、脉冲电场凝胶电泳影响分辨率的因素四、脉冲电场凝胶电泳A-+AB-+B垂直或横向交变系统场翻转系统箝位匀强电场系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+四、脉冲电场凝胶电泳A-+AB-+B垂直或横向交变系统场翻转五、凝胶电泳中DNA的检测

五、凝胶电泳中DNA的检测第四章基因工程的主要技术及其原理第四章基因工程的主要技术及其原理108第四章基因工程的主要技术及其原理

第一节DNA和RNA的提取和纯化

第二节凝胶电泳

第三节核酸和蛋白质的分子杂交

第四节聚合酶链式反应技术

第五节DNA序列分析

第六节基因定点诱变

第七节DNA与蛋白质互作分析

第四章基因工程的主要技术及其原理第一节

DNA和RNA的提取和纯化

核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。第一节

DNA和RNA的提取和纯化核酸是遗传信息第一节

DNA和RNA的提取和纯化核酸提取与纯化的原则保持核酸分子一级结构的完整性温度不要过高控制一定的pH值范围(pH值5-9)

保持一定的离子强度减少物理因素对核酸降解的机械剪切力防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。第一节

DNA和RNA的提取和纯化核酸提取与纯化的原则第一节

DNA和RNA的提取和纯化DNA酶抑制剂

金属离子螯合剂：

DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；

阴离子型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。第一节

DNA和RNA的提取和纯化DNA酶抑制剂第一节

DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAase)抑制剂

RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。

皂土（bentonite

）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。

肝素

复合硅酸盐（Macaloid)

RNase阻抑蛋白（RNasin）

氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)第一节

DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAas第一节

DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAase)抑制剂

DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：

DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。剧毒。第一节

DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAase)第一节DNA和RNA的提取和纯化一般程序

1、供体的核酸分离

供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA分离细胞器分离总RNA

分离细胞器DNARNApoly(A)RNA特异性RNA

染色体DNA(组建基因组文库)第一节DNA和RNA的提取和纯化一般程序一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取的几种方法

基因组DNA的提取

CTAB法

SDS法其它

非基因组DNA的提取

质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取的几种方法一、DNA提取的基本原理与方法

基因组DNA-CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-CTAB法原一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的经典配方

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl

提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的经典配方一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的改进配方

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的改进配方一、DNA提取的基本原理与方法CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液一、DNA提取的基本原理与方法CTAB法流程图植物材料裂解一、DNA提取的基本原理与方法

基因组DNA-

SDS法原理

SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

SDS法DNA提取缓冲液组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-SDS法原理一、DNA提取的基本原理与方法SDS法流程图（以动物组织为例）

动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液一、DNA提取的基本原理与方法SDS法流程图（以动物组织为例一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法

根据细胞裂解方式的不同有：

物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法

化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法

生物方式：酶法一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法

根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法硅质材料:高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。

阴离子交换树脂:低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。

磁珠:磁性微粒挂上不同基团可吸附不