植物对逆境的生理响应(2012级)课件

综合实验3植物对逆境的生理响应一、实验教学目的了解植物体内脯氨酸含量测定的意义原理，掌握其测定方法。掌握蒽酮法测定可溶性糖的原理和方法。进一步认识细胞膜系统的结构和功能，掌握电导率仪法测定离体植物叶片的抗逆性的原理与方法。通过高温和低温处理对生物膜的伤害，加深理解不良环境对植物造成的伤害。综合实验3植物对逆境的生理响应二、实验意义植物生长过程中经常会遇到干旱、低温、淹水、热害、盐碱、病虫害等不良环境(逆境)。植物有多种抵抗逆境的形态和生理机制。在生理上，植物可以通过维持细胞膜的完整性，增加脱落酸含量，积累渗透调节物质，活性氧平衡、抗逆基因的表达等方式来提高植物细胞对逆境的抵抗力。其中不良环境对植物组织的伤害程度常通过测定细胞膜的通透性来衡量，而渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖含量的变化是植物抗逆能力强弱的一项重要生理指标。植物发育受多种环境因素的影响图渗透调节和非渗透调节的比较渗透调节表现为细胞主动积累溶质，细胞水势低于土壤水势，水流入细胞，使细胞保持正膨压。而非渗透调节，缺水时细胞未主动积累溶质，细胞水势等于土壤水势，细胞失水虽带来溶质浓度提高，但膨压会消失，并发生质壁分离渗透调节是每个细胞溶质浓度的净增加，而不是由于细胞失水、体积变化引起的溶质相对浓度的增加。综合实验3植物对逆境的生理响应三、实验基本原理在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度在一定范围内与其消光度成正比。综合实验3植物对逆境的生理响应三、实验基本原理可溶性糖在硫酸作用下生成糠醛或羟甲基糠醛化合物，糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮作用形成蓝绿色络合物(糠醛衍生物)，在一定波长范围内，其颜色的深浅与糖含量有定量关系，在625nm波长下的吸光值与可溶性糖含量成正比。综合实验3植物对逆境的生理响应综合实验3植物对逆境的生理响应四、仪器试剂（一）植物体内游离脯氨酸含量的测定（309实验室）1、实验组玻璃仪器：(1)试管8根(2)弯颈漏斗4个(3)移液管6根试剂：(1)3%磺基水杨酸(2)甲苯(3)冰乙酸(4)2.5%茚三酮综合实验3植物对逆境的生理响应四、仪器试剂（二）蒽酮法测定植物组织中可溶性糖的含量（310实验室）1、实验组玻璃仪器：(1)试管8根(2)烧杯和漓管(3)100ml容量瓶4个(4)漏斗4个(5)弯颈漏斗4个试剂：(1)0.1%蒽酮－硫酸水溶液(2)蒸馏水综合实验3植物对逆境的生理响应四、仪器试剂（三）电导率仪法测定离体植物叶片的抗逆性（309、310实验室）玻璃仪器：50ml三角瓶4个试剂：蒸馏水综合实验3植物对逆境的生理响应五、实验材料1、小麦、玉米、棉花、蓖麻、烟草、向日葵等农作物叶片或叶柄；2、黄瓜、茄子、辣椒、豆角、大白菜、萝卜等蔬菜绿叶、心叶、菜心、菜帮等；3、八仙花、红叶石楠、木芙蓉、紫荆、珊瑚树等园林植物叶片或叶柄；4、枫香、木荷、梧桐、泡桐等林木叶片或叶柄。综合实验3植物对逆境的生理响应六、实验设计学生自带玉米、烟草、羊蹄等植物材料利用实验室条件人为设置逆境与正常条件形成对照（如高温与常温，低温与常温，干旱与保湿等），分析逆境对以下生理指标的影响：（一）植物体内游离脯氨酸含量（二）植物组织中可溶性糖的含量（三）植物组织外液电导率值综合实验3植物对逆境的生理响应六、实验设计1、考察旱涝对上述生理指标的影响；2、考察冷热对上述生理指标的影响；3、考察盐碱对上述生理指标的影响；4、考察病害对上述生理指标的影响；5、考察虫害对上述生理指标的影响；6、考察环境污染对上述生理指标的影响；

七、实验步骤1.标准曲线制作（一）植物体内游离脯氨酸含量的测定取2ml脯氨酸标准液(空白用H2O)2ml冰乙酸3ml酸性茚三酮试剂摇匀，沸水浴40min520nm比色冷却，加入5ml甲苯萃取管号1234567葡萄糖标准液（ml)051020304050蒸馏水（ml)100959080706050每管葡萄糖含量(ug/ml)01020406080100七、实验步骤（二）蒽酮法测定植物组织中可溶性糖的含量1.标准曲线制作取1ml葡萄糖标准液(空白用H2O)加入5ml蒽酮试剂摇匀，沸水浴显色10min冷却625nm比色可溶性糖标准曲线（2013年5月21日上午）可溶性糖标准曲线（2013年5月22日上午）可溶性糖标准曲线（2013年5月22日下午）称取等重处理、对照叶圆片（各30片）分别置于三角瓶①、②三角瓶①、②置于干燥器，真空抽气常温静置1h，其间多次摇动三角瓶摇匀，用电导率仪测定各处理和对照的初电导率值(κ1)沸水浴l0min冷却，并在室温下平衡20min放气后摇晃材料下沉各自加入20ml蒸馏水摇匀，测终电导率值(κ2)（三）电导率仪法测定离体植物叶片的抗逆性（一）植物体内游离脯氨酸含量的测定脯氨酸[ug·g-1]=C×V/A×W其中:C为提取液中脯氨酸含量(ug)；

V为提取液总体积（ml）；

A为测定时所吸取的体积（ml）；

W为样品重（g）。八、结果与分析（二）蒽酮法测定植物组织中可溶性糖的含量

可溶性糖含量[%]=C×V×100%/A×W其中:C为标准曲线所得可溶性糖含量（ug·mL-1）

；V为提取液总体积（ml）；

A为测定时所吸取的体积（ml）；

W为样品重（ug）。八、结果与分析（三）电导率仪法测定离体植物叶片的抗逆性按下式计算由于低温或高温胁迫而产生的电解质外渗，称为伤害度。伤害度(%)=(Lt－Lck)×100%/(1－Lck)其中：Lt为处理叶片的相对电导率；Lck为对照叶片的相对电导率。八、结果与分析九、注意事项（一）植物体内游离脯氨酸含量的测定1、配制的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，最好现配现用。2、茚三酮的用量与脯氨酸的含量相关。当脯氨酸含量在10μg•mL-1以下时，显色液中茚三酮的浓度要达到10mg•mL-1，才能保证脯氨酸充分显色。3、测定样品若进行过渗透胁迫处理，结果会更显著。4、此法也可用于干样中脯氨酸含量的测定。九、注意事项（二）蒽酮法测定植物组织中可溶性糖的含量1、分光光度计、比色杯用水冲洗，擦镜纸擦净；比色杯倒液不超2/3；用完后及时洗净!2、实验操作中用强酸注意安全，如外溅，立即用水冲洗和擦洗!3、由于蒽酮与可溶性糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。九、注意事项（三）电导率仪法测定离体植物叶片的抗逆性1、CO2在水中的溶解度较高，测定电导率时要防止高CO2气源和口中呼出的CO2进入试管，以免影响结果的准确性。2、实验温度对溶液的电导率影响很大，故κl和κ2必须在