核酸提取及常见问题分析-王伟

核酸提取及常见问题分析C组王伟2012.7.27

核酸是遗传信息的载体，包括DNA和RNA,是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。核酸的分离与纯化核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子分开。在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的浓缩、保存等几个主要步骤。核酸分离、纯化原则保持核酸分子一级结构的完整性意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。分离核酸原则：

1）温度不要过高；

2）控制pH值范围(pH值5-9)；3）保持一定离子强度；4）减少物理因素对核酸的机械剪切力。二：DNA提取常见问题、原因分析及对策

一：DNA提取方法简介

样本保存和前处理

核酸分离与纯化的步骤样本保存和前处理抗凝血液非抗凝血

微量血液/干血点口拭子/漱口水样本保存和前处理－抗凝血液

保存:柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,使用柠檬酸或EDTA处理血样。加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月；－70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融！样本前处理:1.冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。2.抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。样本保存和前处理－非抗凝血

保存非抗凝血即血凝块。-20℃保存一个月；-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.冻存的血凝块使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血凝块取出后先采取机械破碎的方法将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。

样本保存和前处理－微量血液/血斑

保存微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存；干血点：干燥后室温或4℃保存；样本前处理1.微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。2.血斑加入缓冲液直接进行提取。样本保存和前处理－口腔拭子/漱口水

保存口腔拭子：干燥后室温保存漱口水：4℃保存或离心得到沉淀，-20℃或-70℃保存样本前处理1.拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。2.有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进行核酸提取。3.漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。核酸分离与纯化的步骤

裂解红细胞核酸的释放基因组DNA的分离纯化核酸的收集与保存测定结果分析裂解红细胞哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取非常重要！红细胞裂解有两种方式：采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3倍全血体积加入进行裂解).采用细胞裂解液进行裂解，细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为细胞核沉淀，更方便基因DNA的提取。核酸分离与纯化的步骤

裂解红细胞核酸的释放基因组DNA的分离纯化核酸的收集与保存测定结果分析核酸的释放（一）机械法包括低超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起高分子量线性分子的断裂，因而不适用于染色体DNA的分离纯化。（二）酶法通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。核酸的释放（三）SDS法SDS（十二烷基磺酸钠）：常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸-蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。同时对RNA、DNA酶有抑制作用。核酸的释放–酶法蛋白酶K：裂解包括膜蛋白的游离和与基因组DNA相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组DNA是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组DNA”缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组DNA的纯度更高。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。核酸的释放–SDS法原理SDS阴离子去垢剂高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析，从而释放出出核酸高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNA核酸的释放–SDS法Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；SDS裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；组分Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)核酸分离与纯化的步骤

裂解红细胞核酸的释放基因组DNA的分离纯化核酸的收集与保存测定结果分析基因组DNA的分离纯化一、有机沉淀剂二、介质纯化方法基因组DNA的分离纯化–有机沉淀剂（1）乙醇原理：当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含的乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。基因组DNA的分离纯化–有机沉淀剂

（2）异丙醇原理：异丙醇比较疏水，能够夺取核酸周围的水分，因此核酸能够聚集而发生沉淀。但一般要先加入NaCl/NaAc，沉淀前核酸一般带负电，钠离子与之中和，因此消除同性电荷的相斥，更易沉淀核酸。优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀，异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。基因组DNA的分离纯化–介质介质：是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响较小，分离出的纯度高，比较稳定基因组DNA的分离纯化–介质介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力(不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留)。不过，介质纯化方法的成本是最高的。基因组DNA的分离纯化–介质磁珠法磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃珠的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COOH）等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。核酸分离与纯化的步骤

裂解红细胞核酸的释放基因组DNA的分离纯化核酸的收集与保存测定结果分析核酸的收集与保存核酸的溶解和保存:纯化后的核酸，最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解。DNA则多以弱碱性的Tris或者TE溶解。经典的DNA溶解方法多提倡使用TE溶解，认为EDTA可以减少DNA被可能残留下来的脱氧核糖核酸酶降解。降解的风险：如果操作过程控制得，完全可以直接使用Tris或者水(pH接近7)溶解DNA。基本上，核酸在保存中的稳定性，与浓度成正比而与温度成反比。如果温度合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的pH值不合适导致的水解(DNA在弱碱性更合适)。测定结果分析测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。DNA提取常见问题DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策DNA提取常见问题材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老冻融或细胞衰老提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染尽量取新鲜材料，低温保存避免反复冻融