细菌基因组完成图illuminapacbio结题报告模版

一 项目信 二 工作流 IlluminaHiseq2000实验流 流 流程说 单分子PacBio实验流 实验流 流程说 生物信息分析流 三 项目结果报 原始数据说 原始数据质 原始数据质量剪 数据统 组组 rRNA/tRNA查 .......................................................................................................................15功能注 各数据库结果汇总 COG功能分 KEGG通路分 GO注释统 四 附 附件说 文件解压缩方 文件打开或浏览方 .......................................................................................................................22一 项目信细菌组完成图及分项目2013 二 工作流2.1.1流文库构建→→桥式PCRIllumina收集纯化组利用Covaris进行组DN段化连接A&B琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选，保留一端是A接头、一端是B接头的氢氧化钠变性，产生单链DN段桥式DN段的一端与引物碱基互补，固定在上另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成" (bridge)PCR扩增，产生DNA簇DNA扩增子线性化成为Illumina加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循将"荧光基团"和"终止基团"化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DN段的序列单分子PacBio实验流DNA利用TBS380或Nanodrop2000检测组DNA浓度，保证进行后续实验的DNA质量足够高（无降解单分子建片段化：利用G-tubes方法将组DNA处理成8-10k的片段环”）的结构，称为SMRTBell，如下图；单分子将文库单链环退火，结合到固定的ZMW（zero- waveguides，零模波导孔）底部的聚合酶上结合完成即可上机，原理如下图在一个反应管（SMRTCell：单分子实时反应孔中有许多圆形纳米小孔，即上面提到的ZM（零模波导孔），外径100多纳米，比检测激光波长小（数百纳米），激光从底部打上去后不能小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围（体积20*1021L）里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在中，将背景降到最低。单个ZMW底部固定有一个结合了模板DNA的聚合酶，当加入反应试剂后，每个碱基配对后会发出相应的光并被检测。一个SMRTCell中有15万个ZMW，每个孔中有一个单分子DNA链在高速。原始检测数据的结果，每一个碱基即显示为一个脉冲峰，每分钟>100个碱基的速度，配上高分辨率的光学检测系统，就能实时检进行检测。单分子质量评与第二代中单碱基质量表示方法类似，Q10表示90%的准确度，20表示99%的准确度，以此类推。单分子公司和的文献表明，单个碱基被5个单分子覆盖，该碱基的准确度达到99%。本项目涉及到的生物信息学分析内容见下表（√打勾部分 √√√COG注√√GO注√KEGG注√Nr注√√GIgbk文件提交到三 项目结果报（8~10kb，IlluminaHiseq2000得到的原始图像数据经过BaseCalling转化为序列数据，结果以FASTQ文件格式@HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:19461:N:0:ATTCCT+HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:1946每条read包含4行信息，其中第一行和第三行分别表示read名称和ID（其中，第一行以“@”开头而第三行以“+”开头；第三行中ID可以省略，但“+”不能省略），第二行为read的碱基序列，第四行是第二行中序列的每个碱基所对应的质量值。为方便保存和共享各产生的高通量数据，NCBI数据中心建立了大容量的数据库equenceReadArchive, nlmnih./Traces/sra）来存放共享的原始数据。通过生物信息统计学的方法，对所有reads的每个circle进行碱基分布和质量波动进行统计，可以直观的反映出样本的质量和文库构建质量。下面是本项目IlluminaHiseq2000原始数据的质控图：分别为原始数据碱基分布图（又称为GC偏差图）和原始数据碱基质量分布图。原注：横坐标是reads碱基坐标，纵坐标是所有reads的A、C、G、T、N碱基分别占的百分比。组项目中建 原readsreads的碱基质量（SolexaScale40=Highest15=Lowest），图中垂直红线”Ⅰ”指定的范围是所有reads碱基的综合质量，红色垂直方块是质量的四分位值范围，加黑粗线是质量值的中要内容，下图为单分子Clean数据reads的长度分布统计图：例图单分子Clean数据序列的长度分布统计图与箱线注：横坐标为reads的长度，纵坐标为不同长度reads的数目，从上图中可以看出，本次获得的reads的长度大小主要集中分布在3000-5000bp，质量较高，可以用于后续分析。采用IlluminaHiseq2000技术对样品的DNA分别进行paired-end，构建了300bp片段文库，由于5’端含有非AGCT修剪质量较低的reads末端(质量值小于舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp对经过质量剪切前后的数据分别进序reads数、reads读长、总碱基数、文库平均长度、平均StatisticsofPacBiorawTotalreadsStatisticsofIlluminaHiseq2000rawTotalreads2,525,243,712Read3001205.14StatisticsofIlluminaHiseq2000highqualityTotalreadsPairreads12,070,497XSinglereads2,317,761,9321106.12首先，利用soapdenovo初步组装Illumina数据,然后利用blasR比对单分子数据，根据比对结果对单分子数据进行一次矫正与纠错，目的在于减少单分子长序列中单碱基、缺失的错误；最后利用纠正过的单分子数据进行组装，组装原理与第一代技术类似，即序列之间的overlap关系进行scaffold的连接，使用celera进行后续组装。完成所有scaffold连接以后，再次利用Illumina数据进行校验，同时进行gapclosing的工作，使用为GapCloser（soapdenovo相关）。详细的组装算法原理请见下图：(方法参考：KorenSMCSchatzetal2012Hybriderrorcorrectionanddenovoassemblyofsingle-moleculesequencingreads."NatBiotechnol30(7):693-700.)No.ofallscaffoldsBasesinallscaffolds

12,095,396G+C N No.ofall Basesinall 2,092,092注：N50、N90长度的概念：将各个序列按长度大小排序，从大至小逐一扫描各个序列的长度值，进行累加，当50%N50值，N90值亦同理。N50、N90长度值比平均长度更能准确表示拼接序列的好坏。Contig：群，拼接基于reads之间的overlap区而拼在一起的序列，中间没有GapScaffold：框架序列，基于paired-end或mate-pair文库的序列信息，确定contigs之间的顺序关系，将contigs按顺序排列在一起形成的更长序列，即为scaffold，中间可能有Gap(NNNNN……)分别利用RNAmmer和tRNAscan-SE对组中包含的rRNA和tRNA进行，统计结果见下表tRNAAntiSP-SP-SP-SP--SP-6-利用Glimmer 详见附件predict 下的*gff，的核苷酸序列详见附件predict 下的*ffn，对应的氨基酸文件详见附件predict 下的*faa。结果的统计见下表，分别为数量，总长度，GC含量，占组百分比，平均长度，间区长度，间区GC含量及间区占组百分比等。GeneGene1,807,923GCcontentingeneGeneaverage831Gene1.037genesperIntergeneticregion287,473GCcontentinintergenetic各数据库结果汇总将的蛋白序列分别与Nr、genes、string和GO数据库进行blastp比对（BLAST2.2.24+），从而获*.annotation.xlsx NameoftheQuery Orf LengthoftheQuery NameoftheTopHitfrom NR库中比对到的top DescriptionabouttheTopHitfrom NR库中比对到的top PercentageofSimilarBasesintheTopHigh-ScoringSegmentPairfromNR

NR库中比对到的top NameofTheTopHitfrom Strings库中比对到的top目标序 DescriptionAboutTheTopHitfrom Strings库中比对到的top目标序 PercentageofSimilarBasesInTheHigh-ScoringSegmentPairfrom

Strings库中比对到的top目标序 ClustersofOrthologousGroupsof EukaryoticOrthologous Non-SupervisedOrthologous KO号或 NameoftheKEGG COG是ClustersofOrthologousGroupsofproteins的缩写( nih./COG/)。COG是在对已完成组的物种的蛋白质序列进行相互比较的基础上构建的，COG数据库选取的物种包括各个主要的系通过与string数据库进行blastp比对，可以获得所对应的COG注释结果，并根据COG注释结果对蛋COGannotation/COG_KOG/stringv8.3。样品的组蛋白进行COG功能归类后的统计结果如下图所示例图COG功能分类统计KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，和组百科全书， KEGG将从NCBI等数据库中获得的包括完整和部分的组序列及其序列于KEGGgenes数据库胞周期以及疾病相关通路等。此外，KEGGLIGAND数据库中也收集了各种化学分子、酶以及酶促反应等相关信在物体内，产物不是孤存在而自发挥作的，同物之间通有序的互协调一起行KEGG数据库中丰富的通路信息将有助于从系统水平去了解的生物学功能，例如代谢途径、遗传信息传递以及细胞学过程等一些复杂的生物过程。运用BLAST算法（blastx/blastp2.2.24+）将所获得的与KEGG的数据库(GENES)进行比对，根据比对得到的KO可以获得相应参与的具体生物学通路。KEGG数据库注释结果详见pathway.txt：每个比对到的KO、KO名字以及数据库 pathways/*html：所有例图KEGG通路数据库中MAPKSignaling例图KEGG通路数据库中MAPKSignaling（KO）分类体系（序列高度相似，并在同一条通有相似功能的蛋白质被归为一组KO，而白色背景的产物则不在KO分类体系之列，绿色表示本次所研究能够注释到这些产物上（即认为具有与该节点基因产物相同或相似的功能；圆形节点表示化合物（即底物或产物；白色背景圆角长方形表示与本通路相关联的其他通路。箭头说明：酶反应方向或信息传递方向等；实线表示直接作用，虚线表示间接作用。详细说明请参见：。GO是本体论GeneOntology的缩写（见 要花费大量的时间和精力去分析生物学术语之间的联系，而GeneOntology项目的目的就是为了标准化这些生物学术语，方便生物学家之间的相互交流。GO注释包括3个方面的内容：Cellularcomponent：thepartsofacelloritsextracellularMolecularfunction：theelementalactivitiesofageneproductatthemolecularlevel,suchasbindingorBiologicalprocess：operationsorsetsofmoleculareventswithadefinedbeginningandend,pertinenttothefunctioningofintegratedlivingunits:cells,tissues,ans,andanisms.因此，GO注释更加便于理解背后所代表的生物学意义。通过blast2go对blast结果进行了注释分析，详细的统计图表见附件 ，下图为GO统计图例例图GO功能注释统计分布同源分采用OrthoMCL对所有参与分析的物种的氨基酸（或核苷酸）序列进行比对，选取一定阈值（阈值一般在30%～80%之间，视具体项目情况而定）进行相似性聚类，获得同源的列表。统计每一个蛋白聚类cuser的物种分布情况，可以进行属内或种内的泛组、组的研究。下表为六个菌株进行种内同源分析的列表（例表：D、E、F在每个蛋白聚类内的详细的信息。全组进化树构在同源分析的基础上，选取参与分析的物种都含有且为单一拷贝的同源（避免旁系同源蛋白的干扰，对这些同源进行多序列比对（采用musce，，版本号：v3.7，将所有比齐后的同源串联起来获得全组水平上的比对结果，该结果后续可用多种算法进行全组进化树的构建（MEGA。例图基于NJ法构建的组进化采用mummer或者ACT，进行两个组或多个组序列的共线性分析。共线性分析可以从宏观清晰地显示组水平上的、缺失、翻转、易位等现象，下图是两个菌株组序列的共线性分析的mummer图（例图。例图组共线性分析例组圈图可以全面展示组的特征，如在正、反义链上的分布情况、的COG功能分类情况、GC含量、组岛、同源等。将各种信息综合展示在一张组圈图中，可以使对菌株组的特本分析采用Circos（，版本号：v0.62）进行组圈图的绘制，下图为传统经典的例 注：圈图的最外面一圈为组大小的标识，每一个刻度为0.5Mb；第二圈和第三圈为正链、负链上的CDS，不同的颜色表组平均GC含量，峰值越高表示与平均GC含量差值越大，向内的蓝色部分表示该区域GC含量低于全组平均GC含链越更倾向于转录CDS，为负值时负链更倾向于转录CDS（圈图的形式是灵活多变的，以上只是最传统的形式）。组GeneBank提交数据文件生成及提交列提交的GeneBank格式文件展示：GI利用已获得的组gbk文件，基于不同的GI岛对菌株中包含的GI岛序列进行，注：蓝色和橘黄色线代表两种不同的GI岛结果，红色表示不同的整合结果，第二圈的峰状图表示组的GC含量分布情况。四 附 ||-- ||-- ||--*.scaf 拼接好的scaffold||-- 将scaffold序列拆分为contig|--rRNA ||--* ||--*rRNA ||-- ||-- tRNA的详细信息，包含一级序列和二级结构 ||-- ||--* ||--*faa 信息：orf、所在的contig序列，在contig上的起始、终止位置 ||--*annotation ||-- 存放与nr库blastp结果的文件|||-- (|||--*.nr.blast ||--COG_KOG|||--cog.listorf对应COG|KOG|NOG号|||--cog.sumary|||--orf比对stringsCOG、KOGNOG的具体信息|||--|||--||-- |||--*kegg_table |||--*.pathway_table |||--*.png、*html ||--GO ||每个orfGO号||||orf比对GO库中某GO的具体功能信息|||--Comparative ||--Orthologous |||-- |||--orthomcl_spe