4dna动植物测序和定制芯片-snp流程介绍

物种及相关数据库SNP数据来源定制平台的选择SNP数据筛选与确定生产实验和数据分析物种及相关数据库Part

15一、了解研究的物种该物种是否已有

？如果是植物物种，需了解是几倍体？客户关注的表型性状（表型值）是什么？如何取样？如何选择

？二、该物种是否有参考

组数据？

组大小？三、了解该物种相关SNP等数据库。物种及相关数据库6桃的 组文章Nat

Genet:科学家解析桃树

组郑州果树

研究员

团队与

华大

联合开组重

工作取得阶段性进展。该研究对84份桃种质进行重中国农业展的，在全组水平上绘制了从光核桃到普通桃的进化路线，并鉴定了与人工选择相关的候选

。相关研究结果

于7

《 组生物学》。桃的 组文章桃的转录组文章建成不同品种花、叶、果等组织的11个RNA样品库，完成21.5

G的植物园果树分子育种学科组 研究 通过RNA-seq 技术，量，获得含有完整编码区序列信息的 超

过25000个，另外从

全部的转录序列信息中分析得到简单重复序列（SSR分子标记）17979个；各不同

型之间对比得到的SNP分子标记约一万个。这些序列信息、表达

情况以及分子标记将有助于通过遗传图谱进行桃的关键农艺性状QTL定位，并开发与优异性状紧密连锁的分子标记，应于用桃分子标记辅助育种。8SNP数据来源Part

210SNP数据来源一、公共数据库二、重 结果三、根据已有的SNP数据信息、研究目的确定想要定制SNP的种类（高密度？中密度？低密度？）定制平台的选择Part

312SNP定制 平台的 策略一、AffymetrixAffymetrix

GeneTitan系统；当某个物种需要检测的SNP位点大于100K时具有极高的性价比；Affymetrix

分型

GTC特别擅长于多倍体SNP分型和分析。可以通过高密度

（Screening

Array）验证SNP位，最近也可以对多倍体点，然后选择最终用于定制

的位点。二、Illumina微珠

；iScan系统；GenomeStudio分型物种进行分型研究；13鸡580,000

MarkersCHB1：640,673CHB1&2：1,296,521Affymetrix——Axiom14Affymetrix

ArraysAxiom分型检测原理Axiom 分型技术采用酶介导、单碱基步骤来确保实验分型结果的高度重复性和流程的全自动化。Axiom 实验整个操作流程简单直接，整个实验仅需200ng的起始DNA，在全 组扩增后将产物随机片段化为25到125

bp之间的片段。这些片段纯化后进行重悬浮，与Axiom全 组微孔板 进行杂交。杂交过程完成后进行严谨性洗涤，非特异性背景会被去除而特异性结合被保留。每一个SNP通过表面所发生的多色联接反应来鉴别。当联接反应完成后， 将会在GeneTitan多通道自动化

工作站上完成染色洗涤等步骤，最后进行扫15

描并输出结果。Illumina

Bead

Arrays微珠5’3’

地址序列

探针

29

mer

50

mer微珠：每一个探针由特异的地址序列（对每种微珠进行

，29mer）和特异序列（代表不同的检测信息，如SNP位点序列、

序列等）组成。微珠

的组装：微珠池用微机电技术在光纤末端或硅片基质上蚀刻出微孔（深度约为3毫米的相同凹槽），将“微珠池“内的微珠“倒”入光纤束微孔。光纤：末端蚀刻微孔硅基质片：表面蚀刻微孔每个微孔恰可容纳一个微珠，在力和与微孔壁间流体静力学相互作用下，微珠以“无序自组装”的方式在微孔内组装成。每种类型的微珠平均有30倍左右的重复。微珠直径3

μm,间距5.7

μm一个微珠对应一个微孔Illumina

Bead

Arrays光纤微珠

过程以4种荧光标记进行16种微珠的 为例微珠第1次杂交微珠第2次杂交：微珠使用前要对 上的微珠进行 ，即对 上每一种微珠的类型、位置、数量、信号强弱进行解读，部分不合格的微珠信道将被关闭。 过程也实现

生产的质控。以四种荧光标记进行16种微珠

为例，

过程使用与地址序列互补的且分别标记4种荧光次杂交后探针的探针进行。把标记4种荧光的不同地址序列探针进行组合，每下来进行下一轮杂交，通过多轮杂交达到指数型区分能力。Illumina

SNP检测(INFINIUM：单碱基延伸)检测过程说明：(1)

DNA，NaOH变性。(2)

gDNA恒温过夜， 组全扩增。(3)

扩增产物用随机内切酶酶切片断化。(4)

乙醇沉淀DNA，重新悬浮。(5-6) 杂交：将DN 段与进行杂交， 的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，gDNA酶切后产物与探针互补序列结合，杂交过夜。(7)

。(8)

单碱基延伸及染色：dinitrophenol和biotin标记的核苷酸底物（A/T和C/G）在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gDNA发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，A/T和C/G将分别标记不同的荧光 。(9) 扫描。

(10)

利用 根据两种荧光判读并输出分型结果。Affx和Illumina定制平台的比较SNP数据筛选与确定Part

421SNP数据筛选与确定Tag

SNP位点筛选——————————最小MAFmissing

Genotype%

<0.2-

r2>=0.8ￚ……其他感 的重要区域及候选位点Backbone

SNP位点筛选————————————-窗口大小

ￚ位点位置

ￚ品系情况重复性多态性序列特征ￚ…… -……质控探针筛选SNP探针设计、评估——————————重复性多态性序列特征

ￚ检测效力

ￚ……生产①SNP质量评估，过滤②根据LD情况及参考SNP数据库&参考 组序列组大小，估算③SNP位点初筛所需位点数目；④根据探针位点评估情况，进行再次筛选和过滤，确定最终的位点列表生产Part523生产一般需要约3个月时间。1、定制周期从前期位点选择到拿到定制好的2、可否分批定制最好是同一批定制，Affx的SNP一般保质期在两年左右，如果项目因取样等特殊原因可以提出申请分批定制。实验和数据分析Part625实验Affymetrix

Axiom

SNP检测原理：Illumina微珠SNP检测原理：26Step9

(optional):

“OTV

genoty”

(SNPPolisher

R

Package)Step

8:

QC

SNPs

and

divideinto

six

types

(SNP

Polisher

R

package)GTC4.1.4Steps

to

ExecuteGenoty27质控内容质控详解阈值标准去除样本数去除位点数Step3:

DQC样本DQC0.820--Step5:

Sample

QC

callrate样本QC

callrate97%27--Step6:

PlateQC板质控99%0--Step8:

SNP

QCSNP质控参见附录PPT