16生物化学实验醋酸纤维薄膜电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶

醋酸纤维薄膜电泳法分别血清乳酸脱氢酶同工酶【目的】．把握电泳法分别血清乳酸脱氢酶同工酶的原理与技术。．生疏测定血清乳酸脱氢酶同工酶的临床意义。【原理】H〔多分布于LDH同工酶分为以下五种〔3-8〕。表3-8LDH同工酶的分类与组成分类分类LDH1亚基组成HHHH(H4)LDH2HHHM(H3M)LDH3HHMM(H2M2)LDH4HMMM(HM3)LDH6MMMM(M4)LDHpH8.6过醋酸纤维薄膜电泳可以将血清样品中的各种LDH以乳酸钠〔钾〕为基质，在有氧化型辅酶Ⅰ存在时，LDH可是乳酸脱氢生成NAD+复原为NADH+H+，NADH+H〔NBT)，使其复原为紫LDHLDH活性成正比。其反响如下：LDH〔3-8〕。将各谱带洗脱进展比色分析，即可求得各同功酶的相对百分比。图3-8LDH同工酶电泳图谱【器材】．电泳仪．电泳槽〔用二层滤纸或纱布搭桥〕．恒温水浴．分光光度计．点样器．白瓷盘．玻璃板．镊子【试剂】．pH8.6巴比妥电泳缓冲液〔离子强度0.05〕20.6g，巴比妥3.68g，蒸馏水加至2000ml。．pH7.5磷酸盐缓冲液〔0.1M〕磷酸二氢钾2.16g，磷酸二氢钠30.13g，蒸馏水加至1000ml。箱保存。．吩嗪二甲酯硫酸盐液吩嗪二甲酯硫酸盐0.5g，蒸馏水加至500ml．氯化硝基四氮唑蓝液

℃冰1.25gpH7.5300ml(．1M乳酸钠液〔或0.5M乳酸钠液〕70%～80%液体乳酸钠8ml200ml为0.5M70%～80%16ml，加水到200ml为1M乳酸钠液。．染色应用液NAD+40mg0.1M磷酸盐缓冲液4ml，氯化硝基四氮唑蓝12ml，1M乳4ml1.2ml．洗脱剂9份，无水乙醇1份，混匀。．固定液10%【操作】．预备15～20min〔液面，待膜全部潮湿后在将膜浸入液内〕。取出后用干滤纸吸去多余的水分。．点样应细窄均匀集中〕。．电泳〔点样面〕朝下，点样端在阴极端，膜条与滤纸紧贴、拉直，然后盖上槽盖，平衡5min后即可通电。电压为25V/cm30～40min，关闭电源，电泳完毕。．染色2.5cm8cm醋纤膜一条，3740min5～10min〕，LDH活性的地方即可显出紫色区带。．定量10min2ml液中，待膜溶解、色泽浸出以后用分光光度计在560nm波特长以洗脱液调“0”，求得各管吸光度。【计算】血清中，某种LDH同工酶占血清总LDH的百分比，按以下公式计算：【留意事项】24h内做完。。．缓冲液pH要准确。．电泳时温度不宜过高。室温超过25℃时需用冰降温，以免影响酶的活力。H和M有五种以上区带。．也有文献报导人血中存在有抗H或抗M抗体，以至做同工酶分析时含HM亚基的同工酶削减，甚至完全丧失。名脱氢酶〔Nothingdehydrogenase,简称NDH〕也可以产生类似反响，它干扰同工酶分析。在同工酶谱上NDH区带位置相当于LDH1和LDH3处。醋纤膜电泳分别血清LDH同工酶参考正常值见表3-9。表3-9醋纤膜电泳分别血清LDH同工酶参考正常值〔%〕作者作者例数LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5上海闸北中心医院上海闸北中心医院4023～3435～4419～270～50～12福州军区总医院3918～3328～4018～306～162～3．临床意义在不同的组织中LDH同工酶谱是不同的〔表3-10〕，因此，器官损害可以在LDH同工酶谱中反映出来。LDH和某些肝脏疾病的诊断。在心肌堵塞时LDH1LDH2/LDH1的比率低1。LDH5增加者可以做为急性肝炎早期指征，且可以在黄疸消灭之前。持续LDH5LDH4和LDH5LDH4。LDH5性的外科手术后。淋巴瘤和白血病〔伴有溶血性贫血〕时，LDH4均增高。充血性心力衰竭〔代偿失调〕、坏死性肝硬化、肝内肿瘤转移等，LDH5增加。组织LDH同工酶活性组织LDH同工酶活性LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5心脏7324300肝脏48272437骨骼肌0051778肾脏424511