食用菌的基因工程课件

食用菌的基因工程食用菌的基因工程1优选食用菌的基因工程2优选食用菌的基因工程2（1）目的基因；（2）表达元件及表达载体（即将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA）；（3）转化方法（把重组DNA引入某种细胞）；（4）重组体的筛选（把目的基因能表达的受体细胞挑选出来）。

基因工程的主要要素（1）目的基因；基因工程的主要要素3食用菌外源基因表达系统一、宿主的选择食用菌外源基因表达系统一、宿主的选择4现有外源基因表达系统的缺陷大肠杆菌表达系统蛋白质翻译后修饰加工体系不完善，表达蛋白活性低或没有活性低；细胞产生内毒素，影响表达蛋白的纯化；细胞质内表达的目标蛋白形成包涵体颗粒，包涵体要用变性剂溶解，再通过复性才能得到在缓冲液中溶解的蛋白现有外源基因表达系统的缺陷大肠杆菌表达系统蛋白质翻译后修饰加5酵母表达系统表达产物过渡糖基化：酵母细胞合成糖链多为甘露糖残基，常形成过长的侧链，如cel基因的表达；表达产物缺乏糖基化：如人尿激酶基因（uPA）有一O-糖基化位点，酵母缺乏在该位点的糖基化；表达真核生物基因的产物与天然产物在结构上有些差异酵母表达系统表达产物过渡糖基化：酵母细胞合成糖链多为甘露糖残6成本高、工艺复杂；我国20多产家还处于转瓶生产（EPO和乙肝疫苗），年产量不足100g/year；细胞凋亡难以克服（CHO细胞）哺乳动物细胞表达系统丝状真菌表达系统成本高、工艺复杂；我国20多产家还处于转瓶生产（EPO和乙肝7食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌美味可食，营养丰富，是健康食品和保健食品；食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌美味可食，营养丰富，是8培养工艺简单、培养基质来源丰富。不仅可以利用发酵罐大规模深层发酵培养，还可以利用农业下脚料进行工厂化种植；食用菌作为外源基因表达系统的特点培养工艺简单、培养基质来源丰富。不仅可以利用发酵罐大规模深层9食用菌是高等真核生物，表达真核生物的基因活性高；食用菌有良好的蛋白分泌能力，有利于目的蛋白的分离和纯化；遗传转化系统容易建立食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌是高等真核生物，表达真核生物的基食用菌作为外源基因表达10银耳是一食药兼用菌有性繁殖无性繁殖银耳是一食药兼用菌有性繁殖无性繁殖11银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢单核，具有独特的繁殖特性——出芽繁殖，和酵母一样，生长速度快，容易培养银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢单核，具有独特的繁12银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点13银耳芽孢是高等真核生物，翻译后的蛋白质修饰系统完善，表达高价值的真核生物基因的活性高银耳芽孢已有完善的高密度深层发酵培养体系银耳芽孢营养丰富，可食安全银耳芽孢是高等真核生物，翻译后的蛋白质修饰系统完善，表达高价14二、载体构建(一）质粒载体的组成

克隆载体：含抗性基因、自主复制序列（ori）常用克隆质粒载体（1）pUC系列（含ampr、

lacZ、Mutiplecloningsite）（2）pBR322(含ampr、tetr、Mutiplecloningsite)（3）BluescriptM13系列（含ampr、lacZ、Mutiplecloningsite）（4）λ噬菌体载体二、载体构建(一）质粒载体的组成克隆载体：含抗15食用菌的基因工程课件16食用菌的基因工程课件17gpdpromotorgpdpromotor18表达载体:组成：启动子，终止子，目的基因，抗性筛选标记基因。表达载体:19食用菌的基因工程课件20EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’HaeIII5’-GGCC-3’3’-CCGG-5’EcoRI5’-GAATT21食用菌常用启动子：1）ras

（Le.ras.gene）启动子；2）gpd(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase)启动子；3）spr1(serineproteinasegene)启动子；4）trp1（tryptophansynthetasegene）启动子；5）其他：cel1(cellulose-growth-specificgene)启动子、cel3启动子、cel4启动子、pri(primasegene)启动子、gla1(glu-coamylasegene)启动子等。食用菌常用启动子：22筛选标记

（1）营养缺陷型标记：营养缺陷互补标记基因有:A)ural（二氢乳清酸）基因，杨树菇转化;B)pabl(p-氨基苯甲酸)基因，鬼伞、蘑菇遗传转化；C）trp2(色氨酸)基因，鬼伞、蘑菇遗传转化;D）银耳肌醇营养缺陷型菌株。筛选标记23（2）抗生素抗性筛选标记：抗生素抗性筛选标记已在植物、真菌遗传转化子的筛选上广泛使用。主要有：卡那霉素抗性基因（kan+）;氨苄青霉素抗性基因（Amp+)潮霉素抗性基因（Hyg+）;腐草霉素抗性基因（Phl+）;博来霉素抗性基因（Ble+）。在培养基中添加抗生素进行筛选。（2）抗生素抗性筛选标记：24（3）除草剂和杀菌剂抗性筛选标记：

A)如Bialaphos抗性基因;B)杀菌剂Carboxin抗性基因（CbxR）;（3）除草剂和杀菌剂抗性筛选标记：25（4）代谢产物抗性筛选标记

如从鬼伞中分离得到的trp3iar基因。该基因是抗氟基吲哚（5-fluoroindole,5-FL）代谢的，草菇和平菇对潮霉素不敏感，而对5-FL十分敏感，当把trp3iar转入草菇和平菇时，这两种食用菌就能对5-FL产生抗性，达到筛选的目的。（4）代谢产物抗性筛选标记26载体构建策略（１）选择合适的表达载体:含启动子、筛选标记、终止子（２）选择合适的限制性内切酶及其酶切位点举例说明食用菌启动子功能检测载体构建过程载体构建策略举例说明27食用菌的基因工程课件28三、遗传转化方法PEG法；电击法；基因枪法；限制酶介导法；农杆菌介导法；三、遗传转化方法PEG法；29PEG(polyethyleneglycol)法最早是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。主要原理：PEG能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使细胞间的接触和粘连，或是通过引起表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融合或外源DNA的进入。主要应用：酵母、蘑菇、平菇、草菇、鬼伞等（一）PEG法；PEG(polyethyleneglycol)法最早是由30

电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”（Electroporation）形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。该法自1979年Zimmerann发明以来，经过多年的研究和改进，已广泛应用于动物、植物的遗传转化研究上。1991年，RoyerJC等首先采用电激法把编码二氢乳清酸脱氢酶基因URA1导入同源的杨树菇营养缺陷型突变菌株中，获得正常表达的杨树菇，接着蘑菇、平菇、草菇等也用该法进行遗传转化，获得转化子。

（二）电激法电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔31食用菌的基因工程课件32在培养基中添加抗生素进行筛选。发出绿色荧光的银耳芽孢主要原理：限制酶穿透细胞膜和核膜，在特异的酶切位点活体切断染色体DNA，产生的染色体DNA末端就会在宿主细胞酶系的作用下与限制酶切断的线性化的质粒DNA相连接。博来霉素抗性基因（Ble+）。绿色荧光观察（LeicaSP-2）5’-CTGCAG-3’PEG(polyethyleneglycol)法最早是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。PEG(polyethyleneglycol)法最早是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。绿色荧光观察（LeicaSP-2）bisporus）、草菇中。表达产物过渡糖基化：酵母细胞合成糖链多为甘露糖残基，常形成过长的侧链，如cel基因的表达；潮霉素抗性基因（Hyg+）;基因枪法又称微弹轰击法（Microprojectilebombardment）,自KleinTM等1987年首次利用钨粒对洋葱的组织进行轰击试验以来，已被广泛应用于植物的遗传转化。主要原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高气压下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA也随之被带入细胞并整合到植物染色体上，得到表达，从而实现了基因的转化。应用：丝状真菌、蘑菇、草菇。

（三）基因枪法在培养基中添加抗生素进行筛选。基因枪法又称微弹轰击法（Mic33食用菌的基因工程课件34

这是九十年代发展起来的一种能较大幅度提高转化率的方法，其英文为RestrictionEnzyme-MediatedDNAIntegration，简称REMI。它是由SchiestlRH等于1991年第一次在酿酒酵母菌（S.cerevisiae）上创立使用[29]

，1992年KuspaA等在网柄菌（Dictyosteliumdiscoideum）上发展了该法。此法应用于旋孢菌（Cochliobolusheterosporus

）、白色念球菌（Candidaalbicans）和食用菌上的鬼伞（Coprinuscinereus）、香菇（L.edodes）等的遗传转化均能有效地提高转化率。

（四）限制性酶介导的DNA整合法这是九十年代发展起来的一种能较大幅度提高转化率的方法，35主要原理：限制酶穿透细胞膜和核膜，在特异的酶切位点活体切断染色体DNA，产生的染色体DNA末端就会在宿主细胞酶系的作用下与限制酶切断的线性化的质粒DNA相连接。该法亦可作为REMI标签对功能基因进行分离。

主要原理：限制酶穿透细胞膜和核膜，在特异的酶切位点活体切断染36根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）是一种革兰氏阴性的土壤杆菌，它侵染双子叶植物的受伤部位并形成冠瘿瘤，在冠瘿瘤的形成中，农杆菌只留在植物细胞间隙中，其环状质粒Ti上的T-DNA在细菌内被加工、剪切、复制后转入植物细胞并随机插入到植物的基因组中。农杆菌介导的遗传转化系统是一种天然有效的遗传工程系统，已广泛应用于双子叶植物和单子叶植物的遗传转化研究上。（五）农杆菌介导法

根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefacien37应用：1998年deGrootMJA等首先把农杆菌介导法应用于真菌的遗传转化，他以真菌的分生孢子和菌丝为受体成功地把T-DNA转入曲霉（A.awamori）、木霉（Trichodermaharzianum）、链孢霉（Neurosporacrassa

）、双孢蘑菇（A.bisporus

）、草菇中。应用：1998年deGrootMJA等首先把农杆菌介导法38银耳芽孢共转化表达载体实例：银耳芽孢表达系统银耳芽孢共转化表达载体实例：银耳芽孢表达系统39银耳芽孢完整细胞的转化电击转化醋酸锂介导的转化PEG介导的转化银耳芽孢完整细胞的转化电击转化40转化子筛选银耳芽孢Tr01对潮霉素的抗性试验拟转化子在含潮霉素的抗性平板上CK转化子筛选银耳芽孢Tr01对潮霉素的抗性试验拟转化子在含潮霉41转化子鉴定

潮霉素抗性基因PCR鉴定转化子鉴定潮霉素抗性基因PCR鉴定42Southern杂交鉴定（gfp基因）

Southern杂交鉴定（gfp基因）43绿色荧光观察（LeicaSP-2）

黑色背景为兰光下图象,白色背景为白光下图象野生型Tr01绿色荧光观察（LeicaSP-2）野生型Tr0144

gfp绿色荧光蛋白基因在银耳芽孢中的高效表达发出绿色荧光的银耳芽孢发出绿色荧光的银耳芽孢gfp绿色荧光蛋白基因在银耳芽孢中的高效表达发出绿色荧光的45

多功能纤维素酶基因（mfc）在银耳芽孢中的表达滤纸酶活性24.61U/mL多功能纤维素酶基因（mfc）在银耳芽孢中的表达滤纸酶活性246

多功能纤维素酶基因（mfc）在银耳芽孢中的表达CMC酶活性27.32U/mL多功能纤维素酶基因（mfc）在银耳芽孢中的表达CMC酶活性47身体健康，学习进步！身体健康，食用菌的基因工程食用菌的基因工程49优选食用菌的基因工程50优选食用菌的基因工程2（1）目的基因；（2）表达元件及表达载体（即将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA）；（3）转化方法（把重组DNA引入某种细胞）；（4）重组体的筛选（把目的基因能表达的受体细胞挑选出来）。

基因工程的主要要素（1）目的基因；基因工程的主要要素51食用菌外源基因表达系统一、宿主的选择食用菌外源基因表达系统一、宿主的选择52现有外源基因表达系统的缺陷大肠杆菌表达系统蛋白质翻译后修饰加工体系不完善，表达蛋白活性低或没有活性低；细胞产生内毒素，影响表达蛋白的纯化；细胞质内表达的目标蛋白形成包涵体颗粒，包涵体要用变性剂溶解，再通过复性才能得到在缓冲液中溶解的蛋白现有外源基因表达系统的缺陷大肠杆菌表达系统蛋白质翻译后修饰加53酵母表达系统表达产物过渡糖基化：酵母细胞合成糖链多为甘露糖残基，常形成过长的侧链，如cel基因的表达；表达产物缺乏糖基化：如人尿激酶基因（uPA）有一O-糖基化位点，酵母缺乏在该位点的糖基化；表达真核生物基因的产物与天然产物在结构上有些差异酵母表达系统表达产物过渡糖基化：酵母细胞合成糖链多为甘露糖残54成本高、工艺复杂；我国20多产家还处于转瓶生产（EPO和乙肝疫苗），年产量不足100g/year；细胞凋亡难以克服（CHO细胞）哺乳动物细胞表达系统丝状真菌表达系统成本高、工艺复杂；我国20多产家还处于转瓶生产（EPO和乙肝55食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌美味可食，营养丰富，是健康食品和保健食品；食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌美味可食，营养丰富，是56培养工艺简单、培养基质来源丰富。不仅可以利用发酵罐大规模深层发酵培养，还可以利用农业下脚料进行工厂化种植；食用菌作为外源基因表达系统的特点培养工艺简单、培养基质来源丰富。不仅可以利用发酵罐大规模深层57食用菌是高等真核生物，表达真核生物的基因活性高；食用菌有良好的蛋白分泌能力，有利于目的蛋白的分离和纯化；遗传转化系统容易建立食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌是高等真核生物，表达真核生物的基食用菌作为外源基因表达58银耳是一食药兼用菌有性繁殖无性繁殖银耳是一食药兼用菌有性繁殖无性繁殖59银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢单核，具有独特的繁殖特性——出芽繁殖，和酵母一样，生长速度快，容易培养银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢单核，具有独特的繁60银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点61银耳芽孢是高等真核生物，翻译后的蛋白质修饰系统完善，表达高价值的真核生物基因的活性高银耳芽孢已有完善的高密度深层发酵培养体系银耳芽孢营养丰富，可食安全银耳芽孢是高等真核生物，翻译后的蛋白质修饰系统完善，表达高价62二、载体构建(一）质粒载体的组成

克隆载体：含抗性基因、自主复制序列（ori）常用克隆质粒载体（1）pUC系列（含ampr、

lacZ、Mutiplecloningsite）（2）pBR322(含ampr、tetr、Mutiplecloningsite)（3）BluescriptM13系列（含ampr、lacZ、Mutiplecloningsite）（4）λ噬菌体载体二、载体构建(一）质粒载体的组成克隆载体：含抗63食用菌的基因工程课件64食用菌的基因工程课件65gpdpromotorgpdpromotor66表达载体:组成：启动子，终止子，目的基因，抗性筛选标记基因。表达载体:67食用菌的基因工程课件68EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’HaeIII5’-GGCC-3’3’-CCGG-5’EcoRI5’-GAATT69食用菌常用启动子：1）ras

（Le.ras.gene）启动子；2）gpd(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase)启动子；3）spr1(serineproteinasegene)启动子；4）trp1（tryptophansynthetasegene）启动子；5）其他：cel1(cellulose-growth-specificgene)启动子、cel3启动子、cel4启动子、pri(primasegene)启动子、gla1(glu-coamylasegene)启动子等。食用菌常用启动子：70筛选标记

（1）营养缺陷型标记：营养缺陷互补标记基因有:A)ural（二氢乳清酸）基因，杨树菇转化;B)pabl(p-氨基苯甲酸)基因，鬼伞、蘑菇遗传转化；C）trp2(色氨酸)基因，鬼伞、蘑菇遗传转化;D）银耳肌醇营养缺陷型菌株。筛选标记71（2）抗生素抗性筛选标记：抗生素抗性筛选标记已在植物、真菌遗传转化子的筛选上广泛使用。主要有：卡那霉素抗性基因（kan+）;氨苄青霉素抗性基因（Amp+)潮霉素抗性基因（Hyg+）;腐草霉素抗性基因（Phl+）;博来霉素抗性基因（Ble+）。在培养基中添加抗生素进行筛选。（2）抗生素抗性筛选标记：72（3）除草剂和杀菌剂抗性筛选标记：

A)如Bialaphos抗性基因;B)杀菌剂Carboxin抗性基因（CbxR）;（3）除草剂和杀菌剂抗性筛选标记：73（4）代谢产物抗性筛选标记

如从鬼伞中分离得到的trp3iar基因。该基因是抗氟基吲哚（5-fluoroindole,5-FL）代谢的，草菇和平菇对潮霉素不敏感，而对5-FL十分敏感，当把trp3iar转入草菇和平菇时，这两种食用菌就能对5-FL产生抗性，达到筛选的目的。（4）代谢产物抗性筛选标记74载体构建策略（１）选择合适的表达载体:含启动子、筛选标记、终止子（２）选择合适的限制性内切酶及其酶切位点举例说明食用菌启动子功能检测载体构建过程载体构建策略举例说明75食用菌的基因工程课件76三、遗传转化方法PEG法；电击法；基因枪法；限制酶介导法；农杆菌介导法；三、遗传转化方法PEG法；77PEG(polyethyleneglycol)法最早是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。主要原理：PEG能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使细胞间的接触和粘连，或是通过引起表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融合或外源DNA的进入。主要应用：酵母、蘑菇、平菇、草菇、鬼伞等（一）PEG法；PEG(polyethyleneglycol)法最早是由78

电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”（Electroporation）形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。该法自1979年Zimmerann发明以来，经过多年的研究和改进，已广泛应用于动物、植物的遗传转化研究上。1991年，RoyerJC等首先采用电激法把编码二氢乳清酸脱氢酶基因URA1导入同源的杨树菇营养缺陷型突变菌株中，获得正常表达的杨树菇，接着蘑菇、平菇、草菇等也用该法进行遗传转化，获得转化子。

（二）电激法电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔79食用菌的基因工程课件80在培养基中添加抗生素进行筛选。发出绿色荧光的银耳芽孢主要原理：限制酶穿透细胞膜和核膜，在特异的酶切位点活体切断染色体DNA，产生的染色体DNA末端就会在宿主细胞酶系的作用下与限制酶切断的线性化的质粒DNA相连接。博来霉素抗性基因（Ble+）。绿色荧光观察（LeicaSP-2）5’-CTGCAG-3’PEG(polyethyleneglycol)法最早是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。PEG(polyethyleneglycol)法最早是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。绿色荧光观察（LeicaSP-2）bisporus）、草菇中。表达产物过渡糖基化：酵母细胞合成糖链多为甘露糖残基，常形成过长的侧链，如cel基因的表达；潮霉素抗性基因（Hyg+）;基因枪法又称微弹轰击法（Microprojectilebombardment）,自KleinTM等1987年首次利用钨粒对洋葱的组织进行轰击试验以来，已被广泛应用于植物的遗传转化。主要原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高气压下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA也随之被带入细胞并整合到植物染色体上，得到表达，从而实现了基因的转化。应用：丝状真菌、蘑菇、草菇。

（三）基因枪法在培养基中添加抗生素进行筛选。基因枪法又称微弹轰击法（Mic81食用菌的基因工程课件82

这是九十年代发展起来的一种能较大幅度提高转化率的方法，其英文为RestrictionEnzyme-MediatedDNAIntegration，简称REMI。它是由SchiestlRH等于1991年第一次在酿酒酵母菌（S.cerevisiae）上创立使用[29]

，1992年KuspaA等在网柄菌（Dictyosteliumdiscoideum）上发展了该法。此法应用于旋孢菌（Cochliobolusheterosporus

）、白色念球菌（Candidaalbicans）和食用菌上的鬼伞（Coprinuscinereus）、香菇（L.edodes）等的遗传转化均能有效地提高转化率。

（四）限制性酶介导的DNA整合法这是九十年代发展起来的一种能较大幅度提高转化率的方法，83主要原理：限制酶穿透细胞膜和核膜，