液相色谱-核磁共振联用技术在药物分析及体内药物分析中的应用

液相色谱一核磁共振联用技术在药物分析

及体内药物分析中的应用摘要：本文详细的介绍了液相色谱一一核磁共振联用的原理和操作技术，列举了该技术在药物分析及体内药物分析之中的应用；讨论了目前液相色谱一一核磁共振在实际工作中存在的主要问题及其适用条件。关键词：高效液相色谱，核磁共振，药物分析，体内药物分析前言液相色谱-核磁共振(LC-NMR)联用技术并不是一个新概念。早在70年代末就有LC-NMR联用技术的报道。将高分离能力的高效液相色谱(HPLC)与提供最丰富结构信息的NMR结合似乎是很自然的事，实际上由于这两种技术存在着固有的矛盾:NMR的检测灵敏度明显比HPLC低，且作为HPLC流动相的混合溶剂往往产生多重强溶剂峰而影响溶质峰的正确检测，因此HPLC和NMR的联用并不是两种技术的简单组合。长期以来人们一般先用HPLC对混合物进行分离，然后将分离好的组分移至NMR试管中，再进行NMR检测，最后确定混合物中该组分的结构，整个过程要耗费很多时间。近年来随着NMR理论和技术的发展，出现了许多新技术新方法。高性能脉冲梯度场技术和选择激发技术的出现，使得多重溶剂峰的有效抑制成为可能。高场探头性能的不断改进，大大提高了NMR的检测灵敏度。NMR谱仪的模块化设计和硬件的快速控制，使得接口设计更为灵活。这些技术解决了HPLC和NMR的匹配问题。由于HPLC-NMR一体化联用技术能一次性完成从样品的分离纯化到峰的检测、结构测定和定量分析，提供大量分子结构和混合物组成的信息，提高了研究效率和灵活性，因此引起人们的广泛关注，并获得快速发展。本文主要阐述液相色谱-核磁共振的原理、操作技术，讨论液相色谱-核磁共振在实际工作中存在的主要问题及其适用条件。并列举了该技术的药物分析及体内药物分析之中的应用。液相色谱-核磁共振的原理样品注入高效液相色谱系统内，在高压泵的推动下，各组分得以分离，并依次经过常规的紫外(UV或DAD)检测器，此后柱流出液可通过聚四氟乙烯导管直接或间接流入超导核磁共振仪内部，就实现了LC-NMR的联用。LC-NMR联用技术需要解决LC和NMR的接口、流体匣(flowcell)的设计、溶剂峰压制、液相和核磁溶剂的选择和NMR灵敏度等问题［2］1.1LC-NMR的流体匣和探头LC-NMR内部的核心探测系统是一个U形的流体匣，这是专门为LC-NMR设计的探头(probe)装置［2］。流出紫外检测器的组分通过聚四氟乙烯的毛细导管直接流入流体匣内，流体匣中有一鼓起的部分，为流体匣的测量部位，其直径为2〜4mm，体积为60〜250^L。检测线圈(detectioncoil)则直接围绕在该测量部位的外围，这样可以得到最佳的填充系数(filingfactor,0=Vs/Vc,Vs和Vc分别代表样品和NMR线圈的体积)，使样品与线圈之间作用最紧密，大大提高了灵敏度。流体匣出口通常接入废液瓶或者样品收集器。1.2NMR的灵敏度众所周知，NMR的灵敏度是比较低的，这也是制约HPLC—NMR发展的问题。NMR的信噪比与样品浓度、磁场强度、检测线圈的填充因子、弛豫时间、扫描次数等有关。高场强(700M、800M甚至900M)NMR的运用，以及软件滤波、消噪技术的发展，都极大地提高了NMR的灵敏度。此外还可采用超低温的探头和前置放大器，由于低温冷却电子元件可减少电子元件的噪音，因此可使NMR的灵敏度提高三至四倍［3、4］。随着技术的进步，利用HPLC—NMR进行复杂微量天然产物的研究将变得更加容易。1.3溶剂的选择和溶剂峰压制由于HPLC的流动相中含有大量的H，它将产生比被分离的化合物强的多的NMR信号。因此要从中检测到微量的样品信号，必须采用适当的脉冲序列来抑制溶剂的信号。目前最常采用的抑制溶剂峰的脉冲序列是在混和时间和弛豫延迟期内对溶剂的共振信号进行选择性照射的常规一维NOESY序列，用于一维谱测试；此外还有基于脉冲场梯度的WET(watersuppressionenhancedthroughT1effects)序列，可用于一维和二维谱测试。此外，使用氘代溶剂作为HPLC的洗脱液，可以很好的抑制洗脱液信号，从而降低对NMR动态范围的要求。1.4HPLC分离条件的优化由于NMR的信噪比(S/N)与样品的浓度和测定时间的平方根成正比，因此使尽量多的样品进入流体匣的有效区域是非常重要的。直接LC-NMR的灵敏度还取决于流体匣的有效体积(activevolume)与色谱峰的洗脱体积(流速X峰宽)之间的比例。在大部分应用常规色谱柱进行的直接LC-NMR分析中，仅有25%〜60%的样品可在探头中被测量。因此，优化HPLC的操作条件，如待测样品的溶解度、洗脱溶剂及洗脱条件的选择等S,争取达到尽量大的载样量和尽量尖锐的色谱峰是非常必要的。开发新型HPLC分析条件有助于充分发挥HPLC-NMR的作用，如以C30固定相代替常规的C8或C18固定相，允许更大的进样量、改善峰形并更好地分离各组分，保证对较复杂混合物中微量组分的结构鉴定。HPLC-NMR联用装置和特点在HPLC-NMR联用系统中，HPLC可以看作是NMR的一种进样装置，试样经HPLC分离后，通过一个适当的中间连接装置注入到NMR探头。由于HPLC分离和NMR分析的样品都处于液体状态，使用温度范围也相近，因此这两种谱仪联用时不必作太多的改动。图1给出了一种典型的HPLC-NMR联用装置。它是由泵、紫外检测器、色谱柱和注入阀组成LC系统，通过一条2〜2.5m长的特制毛细管连接到NMR液相探头上。位于NMR探头底部的阀用来控制NMR测试是在停流状态下还是在连续流动状态下进行。在图1所示的系统中，可以将NMR视为HPLC的特殊检测器。我们知道，HPLC所用的检测器FID、TCD、ECD和RI等都有局限性，而NMR信号的化学位移、积分强度和谱线分裂情况能提供丰富的定量定性信息。图1HPLC-NMR的实验布局高效液相色谱一核磁共振联用技术在药物分析中的应用LC-NMR联用技术能使微量天然混合物中主要组分的化学结构及立体结构得到证实，充分体现了其微量、快速的特点。王映红等⑹建立了检测微量级蛇葡萄Ampelopsissinica根提取物中混合组分结构的HPLC—NMR法，采用停止流动的方法对混合物的各个组分进行分离并获得1HNMR及COPY谱，结果鉴定出其中主要成分的结构为白藜芦醇四聚体。次年他们⑺又联合微量探头技术对蛇葡萄根提取物、买麻藤属植物提取混合物垂子买麻藤（GnetumendulumC.Y.Cheng）、景洪哥纳香（GronithalamusCheliensis）提取混合物进行了分离鉴定［8］。3.1实验方法⑹3.1.1仪器及实验条件蛇葡萄根（8kg）用95%的酒精提取三次，所得浸膏（430g）在沙氏提取器中提取，以氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇分别提取。乙酸乙酯部分（66g）用硅胶柱分为七份（A-G）第五份（E）通过硅胶柱又分为六份（E1-E6）,E1通过MPLC得到一份混合物（2mg）。采用Varian公司的LC-NMR联用仪，其中高效液相色谱仪为Prostar-230，分析柱为InertsilODS-3柱（250*4.6nm）。流动相为D2O,CH3CN，采用梯度洗脱，其洗脱比例为D2O:CH3CN=57:43（0-10min），以后逐渐增加乙腈的比例至40分钟时达到D2O:CH3CN=40：60，流速为1ml/min，检测器为VarianProstar-330二极管振列检测器，紫外检测波长为280nm。将2mg混

合物样品溶于80ug乙腈和水的混合溶剂中。3.2实验内容：在Mercury-300核磁共振仪上采集普通的混合物的HNMR谱，内标为TMS，以CD3OD为溶剂，采样时间1.5s，累加次数为32次。在INOVA-500LC-NMR上，用停止流动的方法采集LC-NMRHNMR谱及WEGCOSY谱。进样量为25ul，HNMR谱采样时间为1.5s，累加次数为416。WETGCOSY的F1、F2均为60000.0hz，nt=24,ni=128总采样时间为1h7min37s。3.3实验结果三套)4-羟基苯基上的A2B2系统的质子信号；一套3位取代的4-羟基苯基上的ABX系统的质子信号；两套3,5-二羟基苯基上的AB2系统的质子信号；两套2位取代的3,5-二羟基苯基上的AB系统的质子信号；一对反式烯氢的信号；三个二氢苯骈吠喃环上的六个脂肪质子信号。由以上信息，我们可以推测出该化合物的平面结构为(3)。文献中报道的具有该种平面结构的化合物共有三种：VitisinB，HeyneanolA(4)和VitisinC(5)。根据该化合物的三个二氢苯骈吠喃环上的H7,H8的偶合常数均较小为5.5HZ，排除结构(5)的可能性，因(5)中有一对顺式的H7,H8,偶合常数为9.6HZ。因LC-NMR中用乙腈-水为溶剂，稍不同于VitisinB及HeyneanolA的文献［5,6］数据，为此很难直接通过氢谱比较出它们的立体结构2在平面结构确定的基础上，再观察混合物的氢谱，可以明确的比较出混合物主要成分的氢谱数据与"VitisinB完全一致，由此推测出了1的立体构型。液相色谱一核磁共振联用技术在体内药物分析中的应用液相色谱一核磁共振联用技术(HPLC-NMR)能一次性地完成从样品分离纯化到峰的检测、结构测定和定量分析。但这种分析手段目前还存在检出限高、不能分析太大分子等缺点，目前这方面发表的论文数量较少。Spraul9第一次报道了使用HPLC-NMR研究药物代谢，将服用了布洛芬受试者的尿液冷冻干燥处理后，分别用连续流动和驻流操作方法进行分析，并在驻流操作时作了二维谱得到了代谢产物的明确结构。Shockcord］将HPLC-NMR方法用于抗HIV药GW524W91的人体代谢物分析，并作了二维谱图，定出了几种主要代谢产物的结构，后又用类似方法作了抗HIV药GW935U83的药理分析。液相色谱一核磁共振联用技术主要作用及目前存在的问题HPLC-NMR[11能检测到化合物的结构信息，但其灵敏度由组分浓度决定，因此目前该技术研究的主要对象是相当分子质量较小的化合物。当常规天然产物研究方法效率过低甚至无法有效发挥作用时，HPLC-NMR则显示出快速高效的优点，可用于粗提物微量组分的分离及结构鉴定。5.1目前存在的问题1HPLC—NMR的主要缺陷是灵敏度比较低以及必须进行溶剂峰抑制。这些直接影响复杂产物尤其是未知化合物的结构鉴定。实际工作中，HPLC—NMR所提供的信息主要限于以H作为发射道的各类谱，难以直接得到13CNMR信息，这可能是限制该技术广泛用于天然产物研究的最大障碍。这也说明，该技术不适于分析氢谱中特征峰重叠较多、分辨较差的化合物及所含质子过少或季碳原子过多的化合物。且HPLC—NMR常用的反相溶剂系统(如乙腈、甲醇等)与氘代试剂相比，测出的化学位移有一定差别，不利于与文献数据比较鉴定。所以相比其他药学领域，如药物代谢产物鉴定、药物杂质鉴定、组合化学合成产物分析等HPLC—NMR用于研究天然产物的报道相对较少。虽然如此，由于NMR数据在结构鉴定中具有重要作用，而且该联用技术本身也在改进中，所以正确判断HPLC—NMR的适用条件、以合适方法解决实验中的问题就非常重要。5.1.1抑制溶剂峰目前常用的HPLC—NMR实验中最重要的技术问题是溶剂峰的抑制。只有抑制HPLC洗脱液产生的高强度质子信号，NMR才能检测出低浓度的组分物质。与生物分子NMR实验中抑制水峰不同，HPLC—NMR系统通常使用1种以上质子性溶剂，梯度洗脱中它们的共振频率不断改变，化合物在检测池中的连续流动也使这一问题更加复杂。目前广泛使用的WET(watersuppressionenhancedthrough,effects)技术较好地克服了这些困难，其抑制溶剂峰的速度远高于多重预饱和技术等其它传统方法，且适用于多种HPLC—NMR操作模式。此外开发新型溶剂峰抑制序列或研制具有双线圈能进行背景减除的NMR差异探头等㈤l硬件的方法也在不断探索；对所得自由感应衰减(FID)信号进行某些数字化处理也可消除较强的溶剂峰。这些方法的效果有待更多的实验验证。近年来，完全以氘代试剂作为洗脱液用于HPLC—NMR系统的研究也在较快发展，并得到有效应用。如毛细管HPLC—NMR、柱阱集HPLC—NMR等方法中，所用氘代试剂大大减少；以超热重水为洗脱液效果也比较好。这些方法消除了质子性溶剂的干扰信号，无须抑制溶剂峰，并且成本相对较低。由于氘代试剂通常不含质子性杂质，这样也消除了洗脱液中某些杂质产生的干扰。当然这些改进的技术仍存在各自局限性，它们的有效性、实用性以及各自发展前景还有待进一步探索。5.1.2提高灵敏度目前相对较低的灵敏度仍是妨碍HPLC-NMR广泛应用的主要原因。该技术检出限(LOD)相对较低(ug级以下)，但为了得到具有鉴定作用的图谱所需的样品量较大，即图谱的鉴定限(LOSI)比较高。经验表明，用500MHz谱仪、60肚L流动探头以停止流动模式检测大多数小分子，只有当检测池中组分有10〜50ug时HPLC—NMR的1H—NMR谱才比较理想；在100ug以上才可能检测出某些二维谱，如COSY、TOCSY等；连续流动模式下检测灵敏度更低。为了提高灵敏度，可以选择适当的流动探头及磁体，调节NMR谱仪有关参数；或针对不同要求采取适当模式，如停止流动模式检测特定峰、时间分割模式了解粗提物全部组分结构特征等。但更重要有效的措施在于优化系统的HPLC操作条件，如待测样品的溶解度、洗脱液溶剂及HPLC洗脱条件的选择等。另外开发新型HPLC检测条件有助于充分发挥HPLC—NMR的作用，如配置蒸发光散射检测器(ELSD)，分析无发色团的化合物，扩大系统适用范围；以C30固定相代替常用的C8或C18。固定相，允许更大的进样量、改善峰形并更好地分离各组分，保证对较复杂混合物中微量组分的结构鉴定。实验表明，不断改进、优化色谱条件是利用HPLC—NMR的有效途径。展望随着分析科学的不断发展，色谱联用技术已成为一种常规应用的现代分析检测技术。对于混合物的分析，色谱联用技术具有较高的灵敏度、选择性及广泛的适用性，可对提取物中的已知、未知结构的成分及其代谢物进行定性分析，也可有效地对蛋白质及多肽进行分离和鉴定。未来分析方法学的进步将依赖于色谱分离技术及光谱检测能力的发展，随着色谱联用设备的普及，色谱联用技术必将在药物分析研究领域广泛应用闾参考文献：[1]HawJF,GlassTE,Hausler,MotedEandCornHC.Directcouplingofliquidchromatographtoacontinuousflowhydrogennuclearmagneticresonancedetectorforanalysisofpetroleumandsyntheticfuels.Anal.Chem.1980,52:1135〜1140.[2]JaroszewskiJW1HyphenatedNMRmethodsinnaturalproductsresearch,Part2:HPLC-SPE-NMRandothernewtrendsinNMRhyphenation1PlantaMed,2005,71:795〜8021[3]KovacsH,MoskauD,SpraulM1Cryogenicallycooledprobes-aleapinNMRtechnology1ProgrNuclMagnResSpectr,2005,46:131〜1551[4]SpraulM,FreundAS,NastRE,etal1AdvancingNMRSensitivityforLC-NMR-MSUsingaCryoflowProbe:ApplicationtotheAnalysisofAcetaminophenMetabolitesinUrine1AnalChem,2003,75(6):1536〜15411WolfenderJL,NdjokoK,HostettmannK1ThepotentialofLC-NMRinphytochemicalanalysis1PhytochemAnal,2001,12(1):2〜22