中草药干品和鲜品基因组总DNA提取及质量比较研究

中草药干品和鲜品基因组总DNA提取及质量比拟研究【摘要】目的讨论中草药干品和鲜品总DNA的提取方法，并比拟干、鲜品总DNA质量之间的差异，为后续研究奠定基矗方法分别采用SDS法和改进的TAB法提取6种中草药干品和鲜品总DNA,并对其进展核酸含量测定、电泳检测和酶切反响检测。结果改进TAB法提取的DNA质量要高于SDS法，在干品和鲜品样品间,干品提取的DNA质量要高于鲜品。利用TAB法提取鲜品和干品的各6种DNA样品，进展酶切反响得到了明晰的酶切条带。结论改进的TAB法可以获得高质量的中草药总DNA，且该方法得到的干品DNA比鲜品DNA质量更高，酶切验证二者都可以用于进一步的实验分析。【关键词】DNA提取；SDS法；TAB法；液氮Abstrat：bjetiveTexplrethebestttalgeniDNAextratinethdfrthedriedandfreshherbs,andtparetheDNAqualityasafundatinfrfutureresearh.ethdsSDSanddifiedTABethdsereusedtgetDNA,andthententfnulEiaid,andagarsegeleletrphresisandenzyedigestinereused.ResultsDNAashigherqualityusingdifiedTABethdtextrat,anduldgethigherqualityfttalgeniDNAfrdrysaples.ItshedalearenzyedigestinbandsusingsixkindsfDNAbydifiedTABethdextratedfrfreshanddriedsaplesfherbs.nlusinItanbegethigh-qualityfttalgeniDNAbythedifiedTABethd，andanbeusedfrfurtherexperientanalysis.Keyrds：DNAextratin;SDSethd;TABethd;Liquidnitrgen近年来，随着分子生物学技术的开展，DNA分子标记技术已被广泛用于药用植物遗传多样性、系统学、分类学研究，并逐渐浸透到中草药的鉴定领域，推动了中草药鉴定研究的开展［1］。如何快速提取纯洁、完好的大分子DNA也是进展核苷酸序列测定，基因文库构建,PR扩增及RAPD鉴定的根底和关键［2］。中草药细胞通常含有大量的多糖,脂质,色素和酚类物质,严重影响了DNA的提取与纯化,同时这些物质假设与DNA结合那么也会影响后续实验操作。目前植物总DNA的提取方法已有很多的报道,但多见于仅对某一植物而论，目前在中草药领域尚无通用的植物DNA提取方法,需视材料情况进展探究［3，4］。我们选取了不同种的6种草药，并分干品和鲜品，采用改进的TAB法和SDS法，并在实验过程中不断调整实验步骤，分别提取这6种药材的DNA,通过DNA质量检测、凝胶电泳检测和酶切鉴定，以期确定一种可以对多种草药进展总DNA提取的方法，为后续分子生物学的研究奠定基矗1材料1.1药材所有供试样品〔冬青、紫苏、小蓟［5］、杜鹃、益母草［5］、艾草，按上述顺序编号为1～6号〕都采自滨州医学院烟台校区校园，采取鲜嫩的叶片或全株植物，用自来水流水冲洗10in后，用无菌蒸馏水冲洗2～3次，一局部鲜嫩材料直接用于提取DNA，另一局部放进烘箱内于50℃烘干后，再进展DNA提龋1.2仪器电热鼓风枯燥箱，灭菌锅，冰箱，DYY-11B型三恒电泳仪，恒温水浴锅，离心机，天能紫外凝胶成像系统等，均为国产，核酸蛋白定量分析仪为Eppendrf公司消费。1.3试剂EDTA、TAB、琼脂糖、arker、等分子生物学常用试剂购自上海生工生物工程技术效劳，其他常用试剂为国产分析纯。2方法2.1TAB法参照文献［6，7］，并进展调整，简称改进TAB法，详细步骤：2%TAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；取少量叶片或全草置于研钵中，用液氮〔或不用液氮〕磨至粉状；取少量粉末速转入至预冷的离心管中〔约占离心管的1/3高度〕,加800μl冰预冷的STE缓冲液迅速混匀,放置2in后,4℃3000r/in,离心4in,弃上清。重复1次,得沉淀；参加700μl的2%TAB抽提缓冲液，轻轻搅动；置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔5in轻轻摇动，30in后取出；冷却2in后，参加氯仿-异戊醇〔24∶1〕至满管，剧烈振荡2～3in，使两者混合均匀；放入离心机中10000r/in,15℃以上离心1in后，轻轻地汲取上清液，转入新灭菌的离心管内，然后参加600μl的异丙醇，将离心管渐渐上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；10000r/in离心1in后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；1in后，参加800μl75%的乙醇，洗涤DNA；10000r/in离心30s后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；自然风干DNA；参加500μlTE缓冲液溶解，1%琼脂唐凝胶电泳检测，余下样品置于-20℃保存备用。根据是否用液氮研磨样品，区分为改进TAB法A〔用液氮研磨样品〕和改进TAB法B〔不用液氮研磨样品〕。2.2SDS法参照文献［6］，并调整：取少量叶片或全草置于研钵中，用液氮磨至粉状；参加600μl提取缓冲液，轻轻混匀。向管中参加50μl20%SDS溶液，轻轻混匀，65℃保温15in，期间间隔晃动3～4次。参加150μl5l/LKA，混匀，置冰上30in。4℃,10000r/in离心15in,转移上清到另一离心管中，参加2/3V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30in。10000r/in离心10in回收总DNA沉淀，参加800μl75%的乙醇，洗涤DNA；10000r/in离心30s后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；自然风干DNA；参加500μlTE缓冲液溶解，1%琼脂唐凝胶电泳检测，余下样品置于-20℃保存备用。2.3DNA浓度及其纯度检测2.3.1DNA浓度测定对提取的DNA，用500μlTE溶解，取20μl的DNA溶液和980μl的超纯水于石英比色皿中混匀,以超纯水为空白,测定D260/D280的比值,并按总DNA浓度(μg/l)=D260×50×稀释倍数计算各种方法提取样品的DNA浓度。2.3.2电泳检测配制1.0%(/V)的琼脂糖凝胶,将上述方法提取的总DNA汲取10μl点样,于0.5×TBE缓冲液中电泳,电场强度为5V/。待溴酚蓝迁移至琼脂糖一多半处时,取出胶,用溴化乙锭〔EB〕染色10in，在凝胶分析系统中观察并拍照。2.4酶切反响鉴定DNA质量分别取以改进TAB法提取的6种中草药的干、鲜品总DNA溶液用RNA酶消化后作为模板，以上海生工消费的HindⅢ和XhI核酸酶进展酶切。37℃20μl反响体系，酶切4h后，电泳检测。反响体系中各物质量如表1。表1反响体系中各物质量〔略〕3结果3.1DNA浓度测定结果3.1.1不同方法提取的DNA质量纯度不同方法提取的DNA质量纯度有明显的差异，以D260/D280比值进展比拟，如表2所示，数值为DNA提取3次后，测量的D260/D280比值的平均值，其中“-〞表示比值偏离太大，弃用。表2不同方法提取的总DNA质量〔以D260/D280值表示〕〔略〕转贴于论文联盟.ll.结果显示改进TAB法A提取的DNA质量要高于SDS法，改进TAB法A提取的DNA质量要高于改进TAB法B提取的DNA；而用改进TAB法提取，在干品和鲜品样品间干品提取的DNA质量要高于鲜品；利用SDS法提取的DNA虽然都用液氮对样品进展了研磨，但是获得的DNA质量要低于改进TAB法提取的，从测量的结果看说明在提取的DNA溶液中含有大量的蛋白质、多糖类等杂质；假如不用液氮研磨样品，TAB法对鲜品DNA的提取质量很低［纯DNA，D260/D280≈1.8(＞1.9,说明有RNA污染；＜1.6，说明有蛋白质、酚等污染〕］。3.1.2不同方法提取的DNA含量对提取的DNA，以500μlTE溶液溶解，分别取20μlDNA溶液用无菌双蒸水稀释50倍，测其DNA含量如表3。表3不同方法提取的总NDA的含量〔略〕不同方法提取的DNA含量也有明显差异，改进TAB法提取的DNA中，鲜样品中提取的DNA含量要高于干品提取的含量，SDS法提取的DNA含量和TAB法提取的鲜品样品DNA含量无明显差异。而在SDS法提取的干品和鲜品样品DNA含量之间差异不明显。3.2电泳检测结果1～6号样品各取10μl进展琼脂糖凝胶电泳,用改进TAB法A提取鲜品样品DNA的电泳图显示条带明晰无拖尾现象〔见图1〕；用改进TAB法A提取干品样品DNA的电泳图显示明晰无拖尾现象，但条带要暗于鲜品，说明DNA含量要低于鲜品提取的DNA含量，也与测定的DNA含量结果相符〔见图2〕；用改进TAB法B对干、鲜品样品提取DNA的电泳图显示，没有用液氮研磨提取的DNA质量有所下降，有明显的拖尾，这也同紫外核酸蛋白仪器测定的结果相符〔见图3〕。用SDS法对干、鲜品样品提取DNA的电泳图显示提取的DNA质量要低于改进TAB法A，但高于改进TAB法B对鲜品样品提取DNA的质量〔见图4〕。3.3酶切检测DNA质量结果根据“3.1〞和“3.2〞的实验结果，本实验选取用改进TAB法A提取的鲜品和干品的6种DNA样品，通过酶切反响后，得到了明晰的酶切图谱〔见图5〕，说明通过本实验探究的改进TAB法A提取的DNA质量较好，可以进一步进展DNA的实验分析。4讨论植物药中的小分子次生代谢产物如萜类、黄酮、香豆素、有机酸、鞣质等含有酚羟基的化合物，氧化后易与DNA结合,引起DNA降解或抑制酶的活性，而植物中存在的多糖类由于与DNA同属大分子化合物，一般提取过程很难去除干净,也可能影响DNA的进一步酶处理或PR扩增［4，8～11］。不同研究显示采用改进的TAB法对单一中草药基因组DNA进展提取,都能多得高质量的DNA［12，13］。本实验采用改进TAB方法，先用预冷的STE抽提液进展处理,能很好的除去多糖；采用15℃以上离心可以防止低温环境下TAB与植物材料共沉淀，从而降低DNA抽提效率；提取过程中取的研磨粉末量要少，一那么细胞裂解充分，二那么可防止后续实验获得的上清液量少，保证提取的DNA的量；同时，同为改进TAB法，唯一区别在是否用液氮研磨材料，对实验的结果影响明显，一般的中草药都比拟难以研磨，鲜材料更加如此，如何快速的得到材料的细粉也极为关键，研磨时间过长，极易造成DNA降解。实验说明，液氮研磨可以起到很好的保护作用，得到的DNA质量高。同时在提取时参加2%或更高量的β-巯基乙醇也有助于获得高质量的DNA。在用异丙醇沉淀DNA时，当有絮状沉淀出现时，用玻璃棒把絮状沉淀挑出，而不用离心沉淀的方式，可以获得更纯的DNA。本实验显示改进TAB法为简便、实用的中草药总DNA提取方法。本实验显示干品比鲜品获得的DNA质量要高，可能通过枯燥，细胞内含水量少，局部酶的活性降低，在提取过程中对DNA的别离造成的干扰变小，更有利于DNA的别离。本实验对上述6份材料DNA样品进展了酶切分析，能获得明晰的酶切图谱，说明无需复杂的纯化过程，只需简单的氯仿：异戊醇(24∶1)抽提，获得的DNA完全可以用于进一步DNA实验分析，但采用液氮研磨是个比拟关键的步骤。本实验利用SDS法进展DNA的提取，发现提取的DNA颜色发黄或褐色，不容易去除色素、蛋白等杂质，DNA质量检测显示D260/D280比值偏低，在操作过程中通过改用苯酚：氯仿：异戊醇〔25∶24∶1〕进展抽提，仍不能有效去除色素、蛋白质等杂质。而有人在玄参中利用SDS法获得了较好质量的DNA［14］，与本实验有一定的差异，说明SDS法也是一种潜在的提取高质量的DNA的方法，可能需要进一步探究改变其中的一些关键步骤。【参考文献】［1］韩艳丽，朱建华.DNA分子标记技术在中草药鉴定中的应用［J］.现代中药研究与理论，2022，22〔4〕：62.［2］李汶，张幼杨.白花蛇舌草的DNA模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