色谱分析基础课件

色谱分析法

Chromatography色谱分析法

Chromatography1.国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的定义

Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationaryphasewhiletheothermovesinadefinitedirection.一、色谱法概述1.国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的定义一、色谱法CaCO3Petroleumether茨维特Experiment色谱法是一种基于物理作用的分离方法。它的特点是：物质在两相中分配，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。CaCO3Petroleumether茨维特色谱法是一种基色谱分析基础课件

色谱法创始人

——俄国植物学家Tswett色谱的历史色谱法创始人

——俄国植物学家Tswett色色谱法的发展1906年Tswett发明色谱的研究方法1954年Martin色谱塔片理论1958年，Giddings毛细管气相色谱1960年代，高效液相色谱1980年代，超临界流体色谱1990年代，大规模制备色谱：生命科学2000年代，多维色谱，超高压色谱，快速制备：蛋白质组学，药物研发色谱法的发展1906年Tswett发明色谱的研究方法Paperchromatography(PC),纸色谱法Thinlayerchromatography(TLC),薄层色谱法Ionexchangechromatography(IEC，IC),离子交换色谱法Gelpermeationchromatography(sizeexclusion,GPC),

凝胶色谱法，体积排阻色谱法Affinitychromatography(AC)，亲和色谱法Gaschromatography(GC),气相色谱法Supercriticalfluidchromatography(SFC)，超临界流体色谱法Highperformanceliquidchromatography(HPLC),高效液相色谱法Capillary(Zone)electrophoresis(CE),毛细管电泳HighSpeedCountercurrent

Chromatography（HSCCC）2.常用的色谱分析方法术语Paperchromatography(PC),纸色谱3.色谱法的分类按流动相的状态分类气相色谱液相色谱超临界流体色谱按固定相的使用形态分类柱色谱纸色谱薄层色谱按分离机理分类：吸附、分配、离子交换、空间排阻……3.色谱法的分类按流动相的状态分类色谱新分类法按分子间相互作用类型：一非特异相互作用色谱疏水相互作用离子作用：离子交换，离子排斥（道南效应）和离子对亲水相互作用……二特异相互作用-亲和色谱免疫亲和固定化金属亲和硼亲和仿生亲和（分子印迹聚合物、适配体、仿生材料）……

色谱新分类法按分子间相互作用类型：4.各种色谱方法的应用（1）薄层色谱法设备简单、操作方便分离速度快（适合多个样品的同时测定）样品预处理简单对被分离物质的性质没有限制直观、可比HPTLC用于人参、三七和西洋参的鉴别最重要的应用领域：药物分析，如中国药典中的TLC鉴别4.各种色谱方法的应用（1）薄层色谱法HPTLC用于人参（2）气相色谱法用于分离分析易汽化、稳定、不易分解、不易反应的样品特别适合用于同系物、同分异构体的分离分离效率高（2）气相色谱法（3）高效液相色谱法用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。分离效率高于TLC分离机理多，应用范围广人参的HPLC谱图（3）高效液相色谱法人参的HPLC谱图超临界流体色谱用于齐聚物分析（4）超临界流体色谱超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SFC)，具有液相、气相色谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比LC有更高的柱效和分离效率。超临界流体色谱用于齐聚物分析（4）超临界流体色谱超临界流体（5）毛细管电泳毛细管电泳用于DNA测序以毛细管为分离通道以高压电场为驱动力依据样品中各组分之间电泳速度和分配行为上的差异生命科学、药物分析、以及从小分子、离子到单细胞分析（5）毛细管电泳毛细管电泳用于DNA测序以毛细管为分离通道电色谱的基本原理和操作结合毛细管电泳的高柱效和高效液相色谱的高选择性色谱柱为填充了HPLC填料的填充型毛细管柱和管内壁涂渍了固定相功能分子的开管毛细管柱以电渗流为流动相驱动力分离机理包含有电泳迁移和色谱固定相的保留机理，溶质与固定相间的相互作用对分离起主导作用。CEC与质谱联用既可解决LC/MS的分离效率不高的问题，又可克服CE/MS中质量流量太小的缺陷。主要应用在药物、手性化合物和多环芳烃的分离分析。电色谱分离酸性化合物电色谱的基本原理和操作结合毛细管电泳的高柱效和高效液相色谱的二、色谱理论基础色谱常用术语色谱峰相关保留值相关分离效能评价相关二、色谱理论基础色谱常用术语peakPeakheightBaselinePeakwidthPeakwidthathalfheightPeakareaStandarderror:σ色谱流出曲线（chromatogram）:

指样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。RetentiontimeDeadtimeσ=0.607h处峰宽的一半W1/2=2.355σW=4σ=1.70W1/2peakPeakheightBaselinePeakw基线:无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线。保留时间:进样到出现色谱峰的时间调整保留时间死体积：色谱柱的空隙体积保留体积：进样到出现色谱峰时消耗的流动相体积调整保留体积：扣除死体积后的保留体积相对保留值：在相同的操作条件下，组分与参比组分的调整保留值之比基线:无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线。分配系数K（distributioncoefficient）：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相浓度的比值容量因子k（retentionfactor，capacityfactor)：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相量的比值相比β（phaseratio）：色谱柱中流动相与固定相相体积之比理论塔板数（柱效）n（Numberoftheoreticalplates

）K=CS/CM

k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0)/t0分配系数K（distributioncoefficient选择性因子αSeparationfactor）：相邻两组分的分配系数或容量因子之比分离度R（Resolutionfactor）：相邻色谱峰保留时间之差的两倍与两色谱峰峰基宽之和的比值

R<1.0 两峰明显重叠R=1.0 两峰达97.7%分离R1.5 两峰完全分开R=0.59R’α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

选择性因子αSeparationfactor）：相邻两组分2色谱理论基础色谱热力学理论试样在两相间分配色谱动力学理论组分在色谱柱中运动，峰宽与传质关系塔板理论速率理论2色谱理论基础色谱热力学理论色谱热力学理论分子间作用力：色散力、诱导力、取向力、氢键气相色谱：溶质与固定相间液相色谱：溶质与固定相、流动相间重要热力学参数分配系数K容量因子k保留值热力学方程GC：温度；HPLC:洗脱强度K=CS/CM

分配系数K与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0)/t0色谱热力学理论分子间作用力：色散力、诱导力、取向力、氢键K=（1）塔板理论目的——从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过这一方程各参数来研究影响分离的因素。假设 （1）色谱柱存在多级塔板;

（2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡;色谱动力学理论（1）塔板理论目的——从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并r——塔板数N——转移次数设：有A、B两组分，kA=2 kB=1/2当N=0 r=0A组分在两相分配达平衡后：流动相分量=固定相分量=r0r1r2。。。。。。。。rnr——塔板数设：有A、B两组分，kA=2当N=下表列出经过各级转移后组分在每一级塔板中的量：下表列出经过各级转移后组分在每一级塔板中的量：色谱分析基础课件色谱流出曲线方程c:流动相流过体积v时柱出口组分浓度；m为进样量；b为与塔板高度、柱长、容量因子等有关的参数V=VR时，mcmax色谱流出曲线方程c:流动相流过体积v时柱出口组分浓度；m为进

由于所获得的流出曲线在N很大时呈正态分布，因此可将流出曲线方程转化为正态分布方程形式：将此方程与标准正态分布曲线方程比较：可知：所以： 由于所获得的流出曲线在N很大时呈正态分布，因此可将流出曲线或：根据：所以：n称为色谱柱的理论塔板数。 因为tR是热力学常数，当色谱柱的长度一定，理论板数目n越大，色谱峰越窄。或：根据：所以：n称为色谱柱的理论塔板数。（2）速率理论概述速率理论是1956年荷兰学者VanDeemter等提出，因此又称作范第姆特方程。运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素。（2）速率理论概述

气相色谱中速率方程的导出根据塔板计算公式：

n=5.54(tR/W1/2)2速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，也就是影响塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu气相色谱中速率方程的导出根据塔板计算公式：涡流扩散项A=2λdp涡流扩散项均匀性因子粒径涡流扩散项涡流扩散项均匀性因子粒径

涡流扩散项A

由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。

涡流扩散项A分子扩散项B/u项其中B=2γDg弯曲因子扩散系数分子扩散项弯曲因子扩散系数

分子扩散项

由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展。

分子扩散项传质阻力项由气相传质阻力和液相传质阻力两项组成传质阻力项由气相传质阻力和液相传质阻力两项组成

气相传质阻力项Cgu

试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。

容量因子气相传质阻力项Cgu容量因子

液相传质阻力项CLu

试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。

液相扩散系数液膜厚度液相传质阻力项CLu液相扩散系数液膜厚度

速率方程给我们的什么启示？为柱型的研究和发展提供理论依据为操作条件的选择提供理论指导为色谱柱的填充提供理论指导速率方程给我们的什么启示？为柱型的研究和发展提供理论依据对柱型研究和发展的影响（1）A=0?Golay1957年提出毛细管柱的概念（opentube）毛细管柱A=0，H=B/u+CuH↓，N↑，分离能力大大提高液体作流动相时可用更细的固定相，A↓对柱型研究和发展的影响（1）A=0?对柱型研究和发展的影响（2）B=0?溶质在液体中的扩散系数DL≈10-5cm2/s溶质在气体中的扩散系数Dg≈10-1cm2/sDL《Dg当采用液体作流动相时

B→0对柱型研究和发展的影响（2）B=0?载气线速度（流速）的影响最佳流速：u=(B/C)1/2实用最佳流速：比最佳流速更快A与流速无关B/u：当流速小时，对H的大小起主导作用Cu：当流速大时，对H的大小起主导作用载气线速度（流速）的影响最佳流速：u=(B/C)1/2操作条件对柱效的影响（1）H-u曲线操作条件对柱效的影响（1）H-u曲线容量因子k的影响不同组分k不同，测出的柱效不同在气相传质阻力相中，k↑

，Cg↑理论上说k越小柱效越高，实际不可取在液相传质阻力相中，k↑，Cl先↑，后↓当k=1时，最大。希望k在一个合适的范围内，通过改变柱温、固定相、柱型参数等可实现。容量因子k的影响不同组分k不同，测出的柱效不同柱温的影响间接影响、十分复杂对k影响，对扩散系数影响，从而对柱效产生影响，但影响情况难以判断柱温的影响间接影响、十分复杂对色谱柱的填充提供理论指导（1）柱径：柱径越小，固定相越难填充均匀。柱长L：柱长增加，总塔板数增加，但分离时间将增加。固定相粒径dp：根据速率方程，粒径减小，A项减小，C项减小，柱效增加。但粒径太小，不易填充均匀，A项又增大。对色谱柱的填充提供理论指导（1）柱径：柱径越小，固定相越难填3.色谱分离基本方程根据该公式优化试验条件，提高分离度R。增大n，α，k值，都可以提高分离度。3.色谱分离基本方程根据该公式优化试验条件，提高分离度R。小结掌握色谱法的基本原理掌握色谱法的分类及可能的应用范围了解影响色谱分离性能的因素小结掌握色谱法的基本原理色谱分析法

Chromatography色谱分析法

Chromatography1.国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的定义

Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationaryphasewhiletheothermovesinadefinitedirection.一、色谱法概述1.国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的定义一、色谱法CaCO3Petroleumether茨维特Experiment色谱法是一种基于物理作用的分离方法。它的特点是：物质在两相中分配，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。CaCO3Petroleumether茨维特色谱法是一种基色谱分析基础课件

色谱法创始人

——俄国植物学家Tswett色谱的历史色谱法创始人

——俄国植物学家Tswett色色谱法的发展1906年Tswett发明色谱的研究方法1954年Martin色谱塔片理论1958年，Giddings毛细管气相色谱1960年代，高效液相色谱1980年代，超临界流体色谱1990年代，大规模制备色谱：生命科学2000年代，多维色谱，超高压色谱，快速制备：蛋白质组学，药物研发色谱法的发展1906年Tswett发明色谱的研究方法Paperchromatography(PC),纸色谱法Thinlayerchromatography(TLC),薄层色谱法Ionexchangechromatography(IEC，IC),离子交换色谱法Gelpermeationchromatography(sizeexclusion,GPC),

凝胶色谱法，体积排阻色谱法Affinitychromatography(AC)，亲和色谱法Gaschromatography(GC),气相色谱法Supercriticalfluidchromatography(SFC)，超临界流体色谱法Highperformanceliquidchromatography(HPLC),高效液相色谱法Capillary(Zone)electrophoresis(CE),毛细管电泳HighSpeedCountercurrent

Chromatography（HSCCC）2.常用的色谱分析方法术语Paperchromatography(PC),纸色谱3.色谱法的分类按流动相的状态分类气相色谱液相色谱超临界流体色谱按固定相的使用形态分类柱色谱纸色谱薄层色谱按分离机理分类：吸附、分配、离子交换、空间排阻……3.色谱法的分类按流动相的状态分类色谱新分类法按分子间相互作用类型：一非特异相互作用色谱疏水相互作用离子作用：离子交换，离子排斥（道南效应）和离子对亲水相互作用……二特异相互作用-亲和色谱免疫亲和固定化金属亲和硼亲和仿生亲和（分子印迹聚合物、适配体、仿生材料）……

色谱新分类法按分子间相互作用类型：4.各种色谱方法的应用（1）薄层色谱法设备简单、操作方便分离速度快（适合多个样品的同时测定）样品预处理简单对被分离物质的性质没有限制直观、可比HPTLC用于人参、三七和西洋参的鉴别最重要的应用领域：药物分析，如中国药典中的TLC鉴别4.各种色谱方法的应用（1）薄层色谱法HPTLC用于人参（2）气相色谱法用于分离分析易汽化、稳定、不易分解、不易反应的样品特别适合用于同系物、同分异构体的分离分离效率高（2）气相色谱法（3）高效液相色谱法用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。分离效率高于TLC分离机理多，应用范围广人参的HPLC谱图（3）高效液相色谱法人参的HPLC谱图超临界流体色谱用于齐聚物分析（4）超临界流体色谱超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SFC)，具有液相、气相色谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比LC有更高的柱效和分离效率。超临界流体色谱用于齐聚物分析（4）超临界流体色谱超临界流体（5）毛细管电泳毛细管电泳用于DNA测序以毛细管为分离通道以高压电场为驱动力依据样品中各组分之间电泳速度和分配行为上的差异生命科学、药物分析、以及从小分子、离子到单细胞分析（5）毛细管电泳毛细管电泳用于DNA测序以毛细管为分离通道电色谱的基本原理和操作结合毛细管电泳的高柱效和高效液相色谱的高选择性色谱柱为填充了HPLC填料的填充型毛细管柱和管内壁涂渍了固定相功能分子的开管毛细管柱以电渗流为流动相驱动力分离机理包含有电泳迁移和色谱固定相的保留机理，溶质与固定相间的相互作用对分离起主导作用。CEC与质谱联用既可解决LC/MS的分离效率不高的问题，又可克服CE/MS中质量流量太小的缺陷。主要应用在药物、手性化合物和多环芳烃的分离分析。电色谱分离酸性化合物电色谱的基本原理和操作结合毛细管电泳的高柱效和高效液相色谱的二、色谱理论基础色谱常用术语色谱峰相关保留值相关分离效能评价相关二、色谱理论基础色谱常用术语peakPeakheightBaselinePeakwidthPeakwidthathalfheightPeakareaStandarderror:σ色谱流出曲线（chromatogram）:

指样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。RetentiontimeDeadtimeσ=0.607h处峰宽的一半W1/2=2.355σW=4σ=1.70W1/2peakPeakheightBaselinePeakw基线:无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线。保留时间:进样到出现色谱峰的时间调整保留时间死体积：色谱柱的空隙体积保留体积：进样到出现色谱峰时消耗的流动相体积调整保留体积：扣除死体积后的保留体积相对保留值：在相同的操作条件下，组分与参比组分的调整保留值之比基线:无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线。分配系数K（distributioncoefficient）：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相浓度的比值容量因子k（retentionfactor，capacityfactor)：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相量的比值相比β（phaseratio）：色谱柱中流动相与固定相相体积之比理论塔板数（柱效）n（Numberoftheoreticalplates

）K=CS/CM

k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0)/t0分配系数K（distributioncoefficient选择性因子αSeparationfactor）：相邻两组分的分配系数或容量因子之比分离度R（Resolutionfactor）：相邻色谱峰保留时间之差的两倍与两色谱峰峰基宽之和的比值

R<1.0 两峰明显重叠R=1.0 两峰达97.7%分离R1.5 两峰完全分开R=0.59R’α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

选择性因子αSeparationfactor）：相邻两组分2色谱理论基础色谱热力学理论试样在两相间分配色谱动力学理论组分在色谱柱中运动，峰宽与传质关系塔板理论速率理论2色谱理论基础色谱热力学理论色谱热力学理论分子间作用力：色散力、诱导力、取向力、氢键气相色谱：溶质与固定相间液相色谱：溶质与固定相、流动相间重要热力学参数分配系数K容量因子k保留值热力学方程GC：温度；HPLC:洗脱强度K=CS/CM

分配系数K与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0)/t0色谱热力学理论分子间作用力：色散力、诱导力、取向力、氢键K=（1）塔板理论目的——从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过这一方程各参数来研究影响分离的因素。假设 （1）色谱柱存在多级塔板;

（2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡;色谱动力学理论（1）塔板理论目的——从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并r——塔板数N——转移次数设：有A、B两组分，kA=2 kB=1/2当N=0 r=0A组分在两相分配达平衡后：流动相分量=固定相分量=r0r1r2。。。。。。。。rnr——塔板数设：有A、B两组分，kA=2当N=下表列出经过各级转移后组分在每一级塔板中的量：下表列出经过各级转移后组分在每一级塔板中的量：色谱分析基础课件色谱流出曲线方程c:流动相流过体积v时柱出口组分浓度；m为进样量；b为与塔板高度、柱长、容量因子等有关的参数V=VR时，mcmax色谱流出曲线方程c:流动相流过体积v时柱出口组分浓度；m为进

由于所获得的流出曲线在N很大时呈正态分布，因此可将流出曲线方程转化为正态分布方程形式：将此方程与标准正态分布曲线方程比较：可知：所以： 由于所获得的流出曲线在N很大时呈正态分布，因此可将流出曲线或：根据：所以：n称为色谱柱的理论塔板数。 因为tR是热力学常数，当色谱柱的长度一定，理论板数目n越大，色谱峰越窄。或：根据：所以：n称为色谱柱的理论塔板数。（2）速率理论概述速率理论是1956年荷兰学者VanDeemter等提出，因此又称作范第姆特方程。运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素。（2）速率理论概述

气相色谱中速率方程的导出根据塔板计算公式：

n=5.54(tR/W1/2)2速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，也就是影响塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu气相色谱中速率方程的导出根据塔板计算公式：涡流扩散项A=2λdp涡流扩散项均匀性因子粒径涡流扩散项涡流扩散项均匀性因子粒径

涡流扩散项A

由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。

涡流扩散项A分子扩散项B/u项其中B=2γDg弯曲因子扩散系数分子扩散项弯曲因子扩散系数

分子扩散项

由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展。

分子扩散项传质阻力项由气相传质阻力和液相传质阻力两项组成传质阻力项由气相传质阻力和液相传质阻力两项组成

气相传质阻力项Cgu

试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间