植物细胞工程jijing

细胞工程（克隆技术）第一页，共五十七页。克隆：无性繁殖系。克隆技术：指从众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或特定类型细胞的技术操作。或对来自特定个体的单个细胞进行无性繁殖，从而产生新个体的过程或技术。分子水平的克隆：指目的基因的复制、分离过程。细胞水平的克隆：把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术，叫做克隆培养法或细胞克隆。个体水平的克隆：通过单个细胞，特别是来自特定个体的单个体细胞进行无性繁殖，从而产生新个体的过程。第二页，共五十七页。水螅酵母菌细菌青霉第三页，共五十七页。第四页，共五十七页。草霉营养生殖

马铃薯落地生根第五页，共五十七页。细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。第六页，共五十七页。第一节植物细胞工程第七页，共五十七页。一、理论基础：细胞的全能性◆概念：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。◆生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，发育成完整个体所必需的全部基因。◆从理论上，生物体的每个活细胞都具有全能性第八页，共五十七页。受精卵的全能性最高生殖细胞（尤其是卵细胞），虽然分化程度高，但仍然具有较高的潜在全能性，可以进行孤雌生殖产生后代。体细胞的全能性比生殖细胞低得多。细胞的全能性植物细胞全能性>动物细胞全能性在植物细胞中受精卵>生殖细胞>具有分化能力的细胞>成熟的体细胞第九页，共五十七页。第十页，共五十七页。概念：在个体发育中，相同细胞的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。特点：持久性胚胎时期达到最大限度结果：形成不同的细胞和组织稳定性和不可逆转性意义：是生物发育的基础第十一页，共五十七页。结论：细胞分化是基因选择性表达的结果

细胞总DNA

细胞总RNA

输卵管细胞

成红细胞

胰岛细胞

输卵管细胞

成红细胞

胰岛细胞

卵清蛋白基因

+

+

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+

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β-珠蛋白基因

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胰岛素基因

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第十二页，共五十七页。

在生物体内，细胞并没有表现出全能性，而是分化称为不同的组织、器官，这是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不相同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。细胞分化实质第十三页，共五十七页。组织特异性基因与管家基因：管家基因（house-keepinggenes）是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必须的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。组织特异性基因（tissue-specificgenes）是指不同的细胞类型进行特异性表达的基因，其产物赋予各种类型细胞特异的形态结构特征与特异的生理功能。如卵清蛋白基因、上皮细胞的角质蛋白基因和胰岛素基因等小资料第十四页，共五十七页。去分化愈伤组织再分化胚状体二、植物细胞工程的基本技术——植物的组织培养第十五页，共五十七页。愈伤组织脱分化再分化第十六页，共五十七页。植物的组织培养

概念：就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞（也称为“外植体”），培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织，根和芽，最终形成完整的植株。条件：离体状态一定的营养物质、激素和其他外界条件第十七页，共五十七页。●离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，长出愈伤组织。细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡得呈无定形状态的薄壁细胞。●经历脱分化（去分化）和再分化的过程。●由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程叫脱分化。●愈伤组织继续进行培养，重新分化的过程叫再分化。细胞分裂、细胞分化、脱分化、再分化的关系

第十八页，共五十七页。再分化脱分化愈伤组织排列疏松，无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞外植体试管苗植株用于离体培养的植物器官或组织片断。（1）配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的含0.7-1%培养基（2）从消毒的根、茎或叶上切取组织块（3）放在固体培养基中培养，获得愈伤组织（4）适当配比营养物质和生长调节剂诱导愈伤组织，直到再生出新植株程序：第十九页，共五十七页。离体的植物器官、组织或细胞脱分化愈伤组织再分化芽、根植物体植物组织培养的过程第二十页，共五十七页。

培养基及其配制

成分:无机营养成分；有机营养成分；激素；琼脂无机盐大量元素磷、钾、硫、钙、氯、镁微量元素铁、硼、锰、锌、钴、钼、铜碳源和能源：蔗糖维生素类：

氨基酸及有机附加物

植物生长调节物质

琼脂

活性炭第二十一页，共五十七页。碳源和能源

植物组织培养中被培养的外植体，由于其光合作用的能力较低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖为最常用，效果也最好。糖类在培养基中除了作为碳源和能源以外，还具有维持培养基一定的渗透压的作用。第二十二页，共五十七页。维生素类

维生素类与植物体内各种酶的形成有关。维生素的种类很多，在植物组织培养中通常以B族维生素为主，其中以盐酸硫胺素（B1）、盐酸吡哆素（B6）、维生素B12、烟酸、生物素和维生素C最为常用。在各种维生素中，Vit.B1可能是必需的。其它可能只对外植体的生长起促进作用。肌醇本身不促进外植体的生长，但可能有助于活性物质发挥作用，从而促进外植体生长、胚状体及芽的形成。第二十三页，共五十七页。氨基酸及有机附加物

在一些培养基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，它们是培养基中重要的有机氮源。在某些植物组织培养中还加入一些天然的有机物，例如椰子乳，酵母提取物，香蕉泥，其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。第二十四页，共五十七页。植物生长调节物质

生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素最为常用。第二十五页，共五十七页。琼脂琼脂是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢，所以在组织培养中一直被作为首选的培养基质而广泛应用。第二十六页，共五十七页。活性炭活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响。例如可以防止酚类物质的污染而引起组织褐化死亡。在兰花组织培养中的效果更明显。另外，活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。活性碳对形态发生和器官形成有良好的效应。

第二十七页，共五十七页。培养基的配制母液种类成分规定量（mg/l）扩大倍数称取量（g）母液定容体积（ml）配1LMS培养基吸取量（ml）大量元素母液1NH4NO316505082.5100020KNO3190095.0MgSO4.7H2O37018.52Cacl2.2H2O44010022.0500103KH2PO41701008.550010微量元素5H3BO36.2500.31100020MnSO4.4H2O22.31.115ZnSO4.7H2O8.60.43KI0.830.0415Na2MoO4.2H2O0.250.0125CuSO4.5H2O0.0250.00125Cocl2.6H2O0.0250.00125铁盐4Na2-EDTA37.31001.86550010FeSO4.7H2O27.81.390有机成分6肌醇1002005.02505甘氨酸20.1烟酸0.50.025VB60.50.025VB10.10.025MS培养基母液成分表第二十八页，共五十七页。培养基配制程序

第二十九页，共五十七页。没有激素的培养基内的植物很少分裂，生长；细胞分裂素大于生长素，生芽；细胞分裂素=生长素，愈伤组织；细胞分裂素小于生长素，生根。第三十页，共五十七页。微型繁殖（快速繁殖）作物脱毒（茎尖、芽尖）人工种子植物细胞工程的实际应用：植物繁殖的新途径作物新品种的培育单倍体育种突变体的利用（分生组织）细胞产品的工业化生产第三十一页，共五十七页。植物繁殖的新途径微型繁殖(特点：繁殖快，性状稳定且整齐一致，无病虫害，周期短，不受自然生长季节限制。)第三十二页，共五十七页。人工种子植物组织培养的方法，诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子。把胚装体胞埋在胶囊内形成球状结构。胶质化合物薄膜——种皮（气体、人工胚乳、机械抗压）营养成分和植物激素——人工胚乳胚状体——新植物的幼体优点：快速繁殖，解决作物繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。固定杂种优势。植物繁殖的新途径局限性：目前，绝大多数人工种子发芽需要无菌条件，所以，还不能实现广泛应用。另外，人工种子的制作费用过高，并且在应用上需要各个环节的配套，这些都限制了人工种子的推广。

第三十三页，共五十七页。作物新品种的培育单倍体育种花药离体培养——单倍体幼苗秋水仙素处理——纯合体杂交育种单倍体育种缩短育种时间花药接种花粉细胞培养愈伤组织分化出小植物脱分化再分化单倍体植株染色体加倍正常植株第三十四页，共五十七页。细胞产品的工业化生产红豆杉细胞生产抗肿瘤紫山醇，60mg/L人参细胞生产人参皂甙植物细胞培养：是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行震荡培养获得游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。

悬浮细胞培养法固定化细胞培养法第三十五页，共五十七页。第三十六页，共五十七页。植物组织培养技术的注意点:①防止细菌的污染，保证培养材料、培养基、培养用具完全无菌。②愈伤组织形成后，要及时进行转接。③影响脱分化的一个重要因素是植物激素。第三十七页，共五十七页。（1）定义：去除植物细胞的细胞壁后就可以得到裸露的球形细胞，称为原生质体。（2）原生质体培养的用途：提供相关生理生化研究（如细胞壁的生物合成、质膜的结构和功能、物质运输、能量转换、信息传递、细胞识别、细胞间相互关系与激素作用等）的材料利用原生质体可以摄取诸如病毒、细菌、细胞器、蛋白质、核酸等外援物质的特点而将其作为研究基因调控和表达、遗传工程研究的材料进行原生质体融合，改变遗传物质，建立杂交品种；同时还可以用于研究染色体行为、基因定位等。用于细胞器的分离，或进行相关细胞器的遗传实验原生质体培养第三十八页，共五十七页。三、植物体细胞杂交概念：两个来自于不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。第三十九页，共五十七页。第一步：去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体——酶解法酶解法——纤维素酶、果胶酶蜗牛酶——反应液转绿取材、除菌分离——洗涤——鉴定测定原生质体的活力有活力的原生质体第四十页，共五十七页。自发融合在酶解细胞壁的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体，

形成的原因：由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。

减少自发融合的措施：在用酶液处理之前，使细胞受到强烈的质壁分离药物的作用，切断胞间连丝。

第四十一页，共五十七页。PEG(聚乙二醇)处理

PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。

诱发融合第四十二页，共五十七页。

电融合将一定密度的原生质体悬浮液置于一个融合小室中，小室两端有电极，在不均匀的交变电场的作用下，原生质体彼此靠近，在两个电极间排列成串珠状。这时，如果有足够强度的电脉冲，就可以使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。第四十三页，共五十七页。第四十四页，共五十七页。

细胞电融合仪第四十五页，共五十七页。融合产物的细胞学

在膜融合以后的数小时内，2个细胞的细胞质混在一起，形成一个双核异核体。在双亲亲缘关系较近的异核体中，两个核有可能同步进行第一次有丝分裂，而且在这个过程中，二者的染色体被一个共同的纺锤体所牵引，在有丝分裂末期形成两个杂种子细胞。最终分化出体细胞杂种，其核内具有双亲的染色体组。第四十六页，共五十七页。融合产物的细胞学

在双亲亲缘关系比较远的杂种细胞中，两个来源不同的染色体组常常不能完全结合在一起。在动物体细胞杂种细胞系中，已知双亲之一的染色体会逐渐消除，在植物中也看到这种现象。第四十七页，共五十七页。第二步：诱导融合方法：物理法：离心、振动、电刺激等化学法：聚乙二醇（PEG）（诱导剂）第三步：筛选杂合细胞鉴别：显微镜互补法筛选细胞分子生物学方法长出植株形态学鉴定第四十八页，共五十七页。根据物理特性选择

根据可见标志选择主要用于非绿色原生质体与含有叶绿体的原生质体的融合。（半绿半白）根据荧光标记选择

将2种原生质体群体分别用不同的荧光染料标记，然后通过荧光显微镜鉴别异核体。

第四十九页，共五十七页。

根据生长和再生能力的差别选择

根据愈伤组织生长差别选择在曼陀罗和烟草种间体细胞杂交以及在小麦和某些其他禾谷类植物属间体细胞杂交中，发现杂种愈伤组织表现生长优势现象，因此融合处理后只要挑选生长快、长的最大的愈伤组织，就会从中分化出体细胞杂种。

第五十页，共五十七页。根据生长和再生能力的差别选择

根据生长和分化对培养基要求的差别选择不同来源的原生质体对培养基成分和激素的要求不同。设计的培养基只有杂种细胞能够生长。第五十一页，共五十七页。筛选杂合细胞杂种细胞的筛选方法有：①细胞系互补的选择方法，包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补和抗性互补等；②利用物理特异