色谱分析法导论课件

周口师范学院·化学系授课老师：刘增臣AnalyticalChemistry分析化学（仪器分析）1周口师范学院·化学系AnalyticalChemistry课程内容解析第一章绪论第三章光学分析法导论第四章原子发射光谱法第五章原子吸收与原子荧光光谱法第六章分子发光分析法第七章紫外-可见吸收光谱法第八章红外吸收光谱法第九章核磁共振波谱法第十章质谱分析法第十一章电分析化学导论第十二章电位分析法第十三章电解及库仑分析法第十四章极谱法与伏安法第十五章色谱法导论第十六章气相色谱法第十七章高效液相色谱法第十八章其它仪器分析方法

光学分析电学分析分离分析其他分析

质谱分析（其他分析）2课程内容解析第一章绪论光学分析电学分析第十五章色谱法导论第一节色谱基本概念第二节色谱理论基础第三节色谱定性定量分析3第十五章色谱法导论第一节色谱基本概念3概述

色谱法又称色层法或层析法，是一种比萃取、蒸馏等更高效、应用更广泛的分析技术。

色谱法早在1906年由俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用。

他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。4概述色谱法又称色层法或层析法，是一种比萃取、蒸

在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相

；

自上而下淋洗运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相

；

装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。5在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（ts6ts6色谱法的实质色谱法的实质是一种物理化学分离分析方法。基于混合物中各组分在互不相容的两相中，具有不同的分配系数，当两相做相对运动时，混合物各组分在两相间进行反复多次的分配。这样就使得那些分配系数只有微小差别的组分在移动速率上产生差别，从而得到分离。7色谱法的实质色谱法的实质是一种物理化学分离分析方色谱法的分类1.按两相物理状态分类

气固色谱(GSC)、气液色谱(GLC)、液固色谱(LSC)、液液色谱(LLC)2.按固定相的固定方式状态分类

(1)柱色谱：填充柱色谱和毛细管柱色谱--固定相安装在柱内或柱壁上。(2)薄层色谱：将固定相涂在玻璃板或塑料板上。

(3)纸色谱：用滤纸做固定相或固定相载体。

8色谱法的分类1.按两相物理状态分类83.按分离机理分类(1)吸附色谱：利用吸附剂对不同组分的吸附性能的差别而进行分离(2)分配色谱：利用不同组分在两相间的分配系数的差别而进行分离(3)其他：离子交换色谱，凝胶色谱，离子对色谱，配合色谱，亲和色谱。4.其它色谱类型

基于色谱过程的特殊物化原理或特殊的操作方式等，色谱法还有其他一些特殊类型，如化学键合色谱、制备色谱、裂解色谱、二维色谱等。93.按分离机理分类(1)吸附色谱：利用吸附剂对不同组分的吸色谱的发展从Tewett建立色谱法至今，色谱法已成为专门的学科。1952

James和Martin发展了气相色谱；是色谱法的革命性进展。1967

Kirkland等研制高效液相色谱法；再一次推动了色谱法的发展。10色谱的发展从Tewett建立色谱法至今，色谱法已成为专色谱法的特点1.分离效率高，可用于分离复杂化合物2.灵敏度高，可以检测到ug/g至ng/g级的物质含量。3.分析速度快4.应用范围广：气相色谱--沸点低于400度；液相色谱--高沸点、热不稳定、生物试样。5.不足：被分离组分的定性问题11色谱法的特点1.分离效率高，可用于分离复杂化合物11第一节色谱基本概念一、色谱分离过程AB两组分吸附能力和分配系数的差别，导致两组分在柱中移动速率不同，经过数次吸附(分配)，组分逐渐分开，先后进入检测器检测。12第一节色谱基本概念一、色谱分离过程AB两组分吸附能力和分配

1313二、色谱常用术语1.色谱图

色谱柱中的流出物通过检测器产生的信号对时间（或流动相体积）的曲线在适当的色谱条件下，每个组分对应的色谱峰一般呈正态分布，色谱图是定性、定量和评价色谱分离情况的基本依据。14二、色谱常用术语1.色谱图142.基线

色谱柱中只有载气无样品通过时，检测器响应信号反应的是系统噪音随时间变化的线称为基线。在实验条件稳定时，基线是一条直线。3.峰高

色谱峰最高点与基线之间的距离4.区域宽度

色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。信号进样空气峰ha色谱流出曲线色谱峰152.基线色谱柱中只有载气无样品通过时，检测器响1.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半(高斯曲线)。2.半峰宽Y1/2---即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为

Y1/2=2.3543.峰底宽度Y---即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是

Y=4161.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半(高斯5.保留值试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，反映了组分与固定相间作用力大小，通常用保留时间和保留体积表示。可以揭示色谱过程的作用机理和分子的结构特征。(1)保留时间tR

试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，是色谱定性的依据。信号进样tR175.保留值试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，反(2)死时间t0

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。信号进样tM(3)调整保留时间tR´

某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即组分在固定相中停留的时间。即tR´=tRt0

18(2)死时间t0

不被固定相吸附或溶解的(4)保留体积VR

指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：

VR=tR

qo(色谱柱出口的载气流量)(5)死体积V0

指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速qo（cm3·min-1）计算。(6)调整保留体积VR

某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。

VR=VR

V0=tR

qo

19(4)保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱(7)相对保留值r2,1(选择性因子α)

某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。

r2,1=tR2/tR1´=VR2/VR1

由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。(8)保留指数Ix

1958年，Kovats提出用正构烷烃系列作为度量被测物质的相对保留值的标准，引进了保留指数的概念。是色谱定性的指标。20(7)相对保留值r2,1(选择性因子α)某组分

正构烷烃的保留指数定义为100z，z为其碳数。在相同的色谱条件下测定被测组分及两个相邻(间隔)正构烷烃的调整保留时间21正构烷烃的保留指数定义为100z，z为其碳数。216.分配系数K

它（K）是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即

K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度

=ρs/ρm

7.分配比k

分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的物质的质量之比。即

k=组分在固定相中的物质的量/组分在流动相中的物质的量

=ms/mm

226.分配系数K它（K）是指在一定温度和压力下，组分在分配系数与分配比之间的关系K=ρs/ρm=

=k.

(相比)8.保留值与分配系数K及分配比k

的关系

保留体积与热力学平衡常数之间K的关系VR=V0+KVsVR=V0（1+k）

tR=t0（1+k）

r2,1=tR2/tR1´=K2/K1=k2/k1

分配系数和分配比都与组分及固定液的热力学性质有关，并随柱温、柱压的变化而变化，分配系数与两相体积无关，分配比则随着固定液的量而变化，k值越大，组分在固定液中的量越多，相当于柱的容量越大。23分配系数与分配比之间的关系K=ρs/ρm=第二节色谱理论基础色谱分离的条件：1.两相邻组分保留值存在一定差别，即洗出两个色谱峰具有足够的距离。受色谱热力学控制(塔板理论)。2.色谱峰区域宽度要窄。受色谱动力学控制(速率理论)。一、塔板理论最早由英国生物学家Martin提出。把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。

24第二节色谱理论基础色谱分离的条件：242525塔板理论假设：1.在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。

这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。3.所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。

简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：

n=L/H

n称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。26塔板理论假设：26n与半峰宽及峰底宽的关系式为：

n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2

组分的保留时间越长，峰形越窄，则理论塔板数n越大，色谱柱效能越高。

计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM，所以常用有效塔板数n有效表示柱效：

n有效=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2

有效板高：H有效=L/n有效

27n与半峰宽及峰底宽的关系式为：27例：已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。解：n=16(tR/Y)2=16（400/40）2

=1600块28例：已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400s，

塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数。

但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。29塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观二、速率理论

1956年荷兰学者vanDeemter（范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。vanDeemter方程的数学简化式为

H=A+B/u+Cu式中u为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。30二、速率理论1956年荷兰学者vanDeemt1.涡流扩散项A

在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。311.涡流扩散项A31由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：

A=2λdp

上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此A=0。32由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分2.纵向扩散项B/u（分子扩散项）

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为

B=2γDm式中：γ——弯曲因子，填充柱γ

空心柱γ=1Dm——组分在流动相中的扩散系数γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子(阻碍因子)，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dm为组分在流动相中扩散系数（cm3·s-1）,分子扩散项与组分在流动相中扩散系数Dm成正比.332.纵向扩散项B/u（分子扩散项）33Dm与流动相及组分性质有关：

(a)相对分子质量大的组分Dm小，Dm反比于流动

相相对分子质量的平方根，所以采用相对分子

质量较大的流动相，可使B项降低；

(b)Dm随柱温增高而增加，但反比于柱压。

另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为了降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。34Dm与流动相及组分性质有关：343.传质阻力项Cu

由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。（1）气液色谱

传质阻力系数C包括气相(流动相)传质阻力系数Cm和液相(固定相)传质阻力系数Cs两项，即

C=Cm+Cs

气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气相。这样使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。353.传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相，液对于填充柱，气相传质阻力系数Cm为：

式中k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数Dm成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cm减小，提高柱效。36对于填充柱，气相传质阻力系数Cm为：36

液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回气/液界面的传质过程。这个过程也需要一定的时间，此时，气相中组分的其它分子仍随载气不断向柱口运动，于是造成峰形扩张。

由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数Ds大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使Cs增大。

37液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动4.载气流速u对理论塔板高度H的影响uuopt理论踏板高度最小，柱效能最高，对应最佳流速HminH384.载气流速u对理论塔板高度H的影响uuopt理论踏板高度最分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献较低线速时，分子扩散项B/u起主要作用；应采用分子质量较大的载气，以使组分在气相中有较小的扩散系数。较高线速时，传质阻力Cu项起主要作用；其中流动相传质阻力项对板高的贡献几乎是一个定值。宜采用低分子质量的载气，以减小气相传质阻力，提高效能。39分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献39

根据速率理论，将上面各式总结，即可得气液色谱速率板高方程，即著名的vanDeemter方程，亦称速率方程。对色谱分离条件的选择有指导意义。

它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。

40根据速率理论，将上面各式总结，即可得气液色谱速三、分离度要实现色谱的分离：首先两峰之间的距离要大，即两组分的保留时间有足够大的差值，其次峰形要陡。41三、分离度要实现色谱的分离：首先两峰之间的距离要分离度R是一个综合性指标。

分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即

R=2(tR2-tR1)/W1+W2

R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R<1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7%。

通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。42分离度R是一个综合性指标。42

当色谱峰峰形不对称或相邻两峰间有重叠时，峰宽较难测量，可用半峰宽代替峰宽R=(tR2-tR1)/（W1/2,1+W1/2,2）将柱效、选择性及分离度联系起来，假设两相邻峰峰宽相等(W1=W2),得到柱效、选择性及分离度之间的关系式：43当色谱峰峰形不对称或相邻两峰间有重叠时，峰宽较难测第三节色谱定性定量分析一、定性分析确定各色谱峰代表的化合物。1、利用保留值定性(1)利用已知物保留值对照定性，色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。目前各种色谱定性方法都是基于保留值的。44第三节色谱定性定量分析一、定性分析44(2)相对保留值法

相对保留值γis是指组分i与基准物质s调整保留值的比值

γis=tri/trS´=Vri/Vrs

它仅随固定液及柱温变化而变化，与其它操作条件无关。45(2)相对保留值法相对保留值γis是指组分i与基（3）双柱保留法

保留值或相对保留值，在同一根色谱柱上不同的组分可能具有相同的数值。即使使用纯物质对照，也可能有误差，需要采用双柱法定性。利用两根极性差别较大的色谱柱对混合物进行分离，然后用纯物质分别在两根柱子上进行保留值对照定性，得到的结果一致，就可以确定该组分，结果比较可靠。

46（3）双柱保留法保留值或相对保留值，在同一根色2.利用文献保留数据定性

在所使用的柱温与固定液相同的条件下，测定未知组分的保留指数，然后与文献发表的Ix对照就可以定性测量。3.利用选择性检测器定性

火焰光度检测器响应---有机化合物电子捕获器有响应----含有卤素、氧等电负性强的基团氮磷检测器有响应----含硫或磷

只能确定某一类化合物的存在，不能指出具体是哪一种组分。4.仪器联用技术

472.利用文献保留数据定性在所使用的柱温与固定液相二、定量分析

定量分析的任务是求出混合样品中各组分的百分含量。色谱定量的依据是，当操作条件一致时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比。即：

mi=fi

Ai

式中mi为被测组分i的质量；Ai为被测组分i的峰面积；fi为被测组分i的校正因子。

48二、定量分析定量分析的任务是求出混合进行色谱定量分析时需要：（1）准确测量检测器的响应信号—峰面积或峰高；（2）准确求得比例常数—校正因子；（3）正确选择合适的定量计算方法，将测得的峰面积或峰高换算为组分的百分含量。49进行色谱定量分析时需要：491、峰面积测量方法

峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积测量的准确与否直接影响定量结果。对于不同峰形的色谱峰采用不同的测量方法。（1）对称形峰面积的测量——峰高乘以半峰宽法对称峰的面积

A=1.065hY1/2

（2）不对称形峰面积的测量——峰高乘平均峰宽法对于不对称峰的测量如仍用峰高乘以半峰宽，误差就较大，因此采用峰高乘平均峰宽法。

A=1/2h（Y0.15+Y0.85）式中Y0.15和Y0.85分别为峰高0.15倍和0.85倍处的峰宽。501、峰面积测量方法峰面积是色谱图提供（2）自动积分仪法2.定量校正因子

色谱定量分析的依据是被测组分的量与其峰面积成正比。但是峰面积的大小不仅取决于组分的质量，而且还与它的性质有关。即当两个质量相同的不同组分在相同条件下使用同一检测器进行测定时，所得的峰面积却不相同。

因此，混合物中某一组分的百分含量并不等于该组分的峰面积在各组分峰面积总和中所占的百分率。这样，就不能直接利用峰面积计算物质的含量。为了使峰面积能真实反映出物质的质量，就要对峰面积进行校正，即在定量计算时引入校正因子。

51（2）自动积分仪法2.定量校正因子51校正因子分为绝对校正因子和相对校正因子。

fi=mi/Ai

式中fi值与组分i质量绝对值成正比，所以称为绝对校正因子。在定量分析时要精确求出fi值是比较困难的。

绝对校正因子主要由仪器的灵敏度决定，不易准确测定。因此在定量分析时，一般采用相对校正因子，即某物质与标准物质的绝对校正因子的比值------质量校正因子、摩尔校正因子、体积校正因子。52校正因子分为绝对校正因子和相对校正因子。(1)质量校正因子f'm。

(2)摩尔校正因子f'M。

(3)体积校正因子f'v。

53(1)质量校正因子f'm。

(2)摩尔校正因子f'M。3.定量分析方法(1)归一化法(2)内标法

所谓内标法，是将一定量的纯物质作为内标物加入到准确称量的试样中，根据试样和内标物的质量以及被测组分和内标物的峰面积可求出被测组分的含量。由于被测组分与内标物质量之比等于峰面积之比，即

mi/ms=Aifi/Asfs所以

mi=msAifi/Asfs

式中下标s代表内标物，i代表组分。若试样质量为m，则

Pi%=(mi/m)100%

=msAifi/Asfsm100%543.定量分析方法(1)归一化法54(3)外标法--标准曲线法(4)内标标准曲线法---简化的内标法如称取同样量的试样，加入恒定量的内标物，则式中为一常数：

首先配制待测组分不同含量的标准溶液，取固定量的标准溶液和内标物混合后进行分析，测得Ai和As，以Ai/As对标准溶液中待测组分的含量组图，分析时，取同样量的试样和内标物混合物，测其峰面积，就可以从标准曲线上查出试样中被测物质的含量。内标标准曲线法不需要测量校正因子，也不需要严格定量进样，适于液体试样的常规分析。

55(3)外标法--标准曲线法(4)内标标准曲线法---简化的内掌握色谱法的定义及理论依据。掌握塔板理论和速率理论所涉及的各个参数的定义。理解色谱定性定量分析的方法。56掌握色谱法的定义及理论依据。56周口师范学院·化学系授课老师：刘增臣AnalyticalChemistry分析化学（仪器分析）57周口师范学院·化学系AnalyticalChemistry课程内容解析第一章绪论第三章光学分析法导论第四章原子发射光谱法第五章原子吸收与原子荧光光谱法第六章分子发光分析法第七章紫外-可见吸收光谱法第八章红外吸收光谱法第九章核磁共振波谱法第十章质谱分析法第十一章电分析化学导论第十二章电位分析法第十三章电解及库仑分析法第十四章极谱法与伏安法第十五章色谱法导论第十六章气相色谱法第十七章高效液相色谱法第十八章其它仪器分析方法

光学分析电学分析分离分析其他分析

质谱分析（其他分析）58课程内容解析第一章绪论光学分析电学分析第十五章色谱法导论第一节色谱基本概念第二节色谱理论基础第三节色谱定性定量分析59第十五章色谱法导论第一节色谱基本概念3概述

色谱法又称色层法或层析法，是一种比萃取、蒸馏等更高效、应用更广泛的分析技术。

色谱法早在1906年由俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用。

他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。60概述色谱法又称色层法或层析法，是一种比萃取、蒸

在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相

；

自上而下淋洗运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相

；

装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。61在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（ts62ts6色谱法的实质色谱法的实质是一种物理化学分离分析方法。基于混合物中各组分在互不相容的两相中，具有不同的分配系数，当两相做相对运动时，混合物各组分在两相间进行反复多次的分配。这样就使得那些分配系数只有微小差别的组分在移动速率上产生差别，从而得到分离。63色谱法的实质色谱法的实质是一种物理化学分离分析方色谱法的分类1.按两相物理状态分类

气固色谱(GSC)、气液色谱(GLC)、液固色谱(LSC)、液液色谱(LLC)2.按固定相的固定方式状态分类

(1)柱色谱：填充柱色谱和毛细管柱色谱--固定相安装在柱内或柱壁上。(2)薄层色谱：将固定相涂在玻璃板或塑料板上。

(3)纸色谱：用滤纸做固定相或固定相载体。

64色谱法的分类1.按两相物理状态分类83.按分离机理分类(1)吸附色谱：利用吸附剂对不同组分的吸附性能的差别而进行分离(2)分配色谱：利用不同组分在两相间的分配系数的差别而进行分离(3)其他：离子交换色谱，凝胶色谱，离子对色谱，配合色谱，亲和色谱。4.其它色谱类型

基于色谱过程的特殊物化原理或特殊的操作方式等，色谱法还有其他一些特殊类型，如化学键合色谱、制备色谱、裂解色谱、二维色谱等。653.按分离机理分类(1)吸附色谱：利用吸附剂对不同组分的吸色谱的发展从Tewett建立色谱法至今，色谱法已成为专门的学科。1952

James和Martin发展了气相色谱；是色谱法的革命性进展。1967

Kirkland等研制高效液相色谱法；再一次推动了色谱法的发展。66色谱的发展从Tewett建立色谱法至今，色谱法已成为专色谱法的特点1.分离效率高，可用于分离复杂化合物2.灵敏度高，可以检测到ug/g至ng/g级的物质含量。3.分析速度快4.应用范围广：气相色谱--沸点低于400度；液相色谱--高沸点、热不稳定、生物试样。5.不足：被分离组分的定性问题67色谱法的特点1.分离效率高，可用于分离复杂化合物11第一节色谱基本概念一、色谱分离过程AB两组分吸附能力和分配系数的差别，导致两组分在柱中移动速率不同，经过数次吸附(分配)，组分逐渐分开，先后进入检测器检测。68第一节色谱基本概念一、色谱分离过程AB两组分吸附能力和分配

6913二、色谱常用术语1.色谱图

色谱柱中的流出物通过检测器产生的信号对时间（或流动相体积）的曲线在适当的色谱条件下，每个组分对应的色谱峰一般呈正态分布，色谱图是定性、定量和评价色谱分离情况的基本依据。70二、色谱常用术语1.色谱图142.基线

色谱柱中只有载气无样品通过时，检测器响应信号反应的是系统噪音随时间变化的线称为基线。在实验条件稳定时，基线是一条直线。3.峰高

色谱峰最高点与基线之间的距离4.区域宽度

色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。信号进样空气峰ha色谱流出曲线色谱峰712.基线色谱柱中只有载气无样品通过时，检测器响1.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半(高斯曲线)。2.半峰宽Y1/2---即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为

Y1/2=2.3543.峰底宽度Y---即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是

Y=4721.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半(高斯5.保留值试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，反映了组分与固定相间作用力大小，通常用保留时间和保留体积表示。可以揭示色谱过程的作用机理和分子的结构特征。(1)保留时间tR

试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，是色谱定性的依据。信号进样tR735.保留值试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，反(2)死时间t0

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。信号进样tM(3)调整保留时间tR´

某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即组分在固定相中停留的时间。即tR´=tRt0

74(2)死时间t0

不被固定相吸附或溶解的(4)保留体积VR

指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：

VR=tR

qo(色谱柱出口的载气流量)(5)死体积V0

指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速qo（cm3·min-1）计算。(6)调整保留体积VR

某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。

VR=VR

V0=tR

qo

75(4)保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱(7)相对保留值r2,1(选择性因子α)

某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。

r2,1=tR2/tR1´=VR2/VR1

由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。(8)保留指数Ix

1958年，Kovats提出用正构烷烃系列作为度量被测物质的相对保留值的标准，引进了保留指数的概念。是色谱定性的指标。76(7)相对保留值r2,1(选择性因子α)某组分

正构烷烃的保留指数定义为100z，z为其碳数。在相同的色谱条件下测定被测组分及两个相邻(间隔)正构烷烃的调整保留时间77正构烷烃的保留指数定义为100z，z为其碳数。216.分配系数K

它（K）是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即

K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度

=ρs/ρm

7.分配比k

分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的物质的质量之比。即

k=组分在固定相中的物质的量/组分在流动相中的物质的量

=ms/mm

786.分配系数K它（K）是指在一定温度和压力下，组分在分配系数与分配比之间的关系K=ρs/ρm=

=k.

(相比)8.保留值与分配系数K及分配比k

的关系

保留体积与热力学平衡常数之间K的关系VR=V0+KVsVR=V0（1+k）

tR=t0（1+k）

r2,1=tR2/tR1´=K2/K1=k2/k1

分配系数和分配比都与组分及固定液的热力学性质有关，并随柱温、柱压的变化而变化，分配系数与两相体积无关，分配比则随着固定液的量而变化，k值越大，组分在固定液中的量越多，相当于柱的容量越大。79分配系数与分配比之间的关系K=ρs/ρm=第二节色谱理论基础色谱分离的条件：1.两相邻组分保留值存在一定差别，即洗出两个色谱峰具有足够的距离。受色谱热力学控制(塔板理论)。2.色谱峰区域宽度要窄。受色谱动力学控制(速率理论)。一、塔板理论最早由英国生物学家Martin提出。把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。

80第二节色谱理论基础色谱分离的条件：248125塔板理论假设：1.在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。

这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。3.所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。

简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：

n=L/H

n称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。82塔板理论假设：26n与半峰宽及峰底宽的关系式为：

n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2

组分的保留时间越长，峰形越窄，则理论塔板数n越大，色谱柱效能越高。

计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM，所以常用有效塔板数n有效表示柱效：

n有效=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2

有效板高：H有效=L/n有效

83n与半峰宽及峰底宽的关系式为：27例：已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。解：n=16(tR/Y)2=16（400/40）2

=1600块84例：已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400s，

塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数。

但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。85塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观二、速率理论

1956年荷兰学者vanDeemter（范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。vanDeemter方程的数学简化式为

H=A+B/u+Cu式中u为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。86二、速率理论1956年荷兰学者vanDeemt1.涡流扩散项A

在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。871.涡流扩散项A31由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：

A=2λdp

上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此A=0。88由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分2.纵向扩散项B/u（分子扩散项）

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为

B=2γDm式中：γ——弯曲因子，填充柱γ

空心柱γ=1Dm——组分在流动相中的扩散系数γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子(阻碍因子)，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dm为组分在流动相中扩散系数（cm3·s-1）,分子扩散项与组分在流动相中扩散系数Dm成正比.892.纵向扩散项B/u（分子扩散项）33Dm与流动相及组分性质有关：

(a)相对分子质量大的组分Dm小，Dm反比于流动

相相对分子质量的平方根，所以采用相对分子

质量较大的流动相，可使B项降低；

(b)Dm随柱温增高而增加，但反比于柱压。

另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为了降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。90Dm与流动相及组分性质有关：343.传质阻力项Cu

由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。（1）气液色谱

传质阻力系数C包括气相(流动相)传质阻力系数Cm和液相(固定相)传质阻力系数Cs两项，即

C=Cm+Cs

气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气相。这样使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。913.传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相，液对于填充柱，气相传质阻力系数Cm为：

式中k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数Dm成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cm减小，提高柱效。92对于填充柱，气相传质阻力系数Cm为：36

液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回气/液界面的传质过程。这个过程也需要一定的时间，此时，气相中组分的其它分子仍随载气不断向柱口运动，于是造成峰形扩张。

由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数Ds大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使Cs增大。

93液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动4.载气流速u对理论塔板高度H的影响uuopt理论踏板高度最小，柱效能最高，对应最佳流速HminH944.载气流速u对理论塔板高度H的影响uuopt理论踏板高度最分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献较低线速时，分子扩散项B/u起主要作用；应采用分子质量较大的载气，以使组分在气相中有较小的扩散系数。较高线速时，传质阻力Cu项起主要作用；其中流动相传质阻力项对板高的贡献几乎是一个定值。宜采用低分子质量的载气，以减小气相传质阻力，提高效能。95分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献39

根据速率理论，将上面各式总结，即可得气液色谱速率板高方程，即著名的vanDeemter方程，亦称速率方程。对色谱分离条件的选择有指导意义。

它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。

96根据速率理论，将上面各式总结，即可得气液色谱速三、分离度要实现色谱的分离：首先两峰之间的距离要大，即两组分的保留时间有足够大的差值，其次峰形要陡。97三、分离度要实现色谱的分离：首先两峰之间的距离要分离度R是一个综合性指标。

分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即

R=2(tR2-tR1)/W1+W2

R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R<1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7%。

通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。98分离度R是一个综合性指标。42

当色谱峰峰形不对称或相邻两峰间有重叠时，峰宽较难测量，可用半峰宽代替峰宽R=(tR2-tR1)/（W1/2,1+W1/2,2）将柱效、选择性及分离度联系起来，假设两相邻峰峰宽相等(W1=W2),得到柱效、选择性及分离度之间的关系式：99当色谱峰峰形不对称或相邻两峰间有重叠时，峰宽较难测第三节色谱定性定量分析一、定性分析确定各色谱峰代表的化合物。1、利用保留值定性(1)利用已知物保留值对照定性，色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。目前各种色谱定性方法都是基于保留值的。100第三节色谱定性定量分析一、定性分析44(2)相对保留值法

相对保留值γis是指组分i与基准物质s调整保留值的比值

γis=tri/trS´=Vri/Vrs

它仅随固定液及柱温变化而变化，与其它操作条件无关。101(2)相对保留值法相对保留值γis是指组分i与基（3）双柱保留法

保留值或相对保留值，在同一根色谱柱上不同的组分可能具有相同的数值。即使使用纯物质对照，也可能有误差，需要采用双柱法定性。利用两根极性差别较大的色谱柱对混合物进行分离，然后用纯物质分别在两根柱子上进行保留值对照定性，得到的结果一致，就可以确定该组分，结果比较可靠。

102（3）双柱保留法保留值或相对保留值，在同一根色2.利用文献保留数据定性

在所使用的柱温与固定液相同的条件下，测定未知组分的保留指数，然后与文献发表的Ix对照就可以定性测量。3.利用选择性检测器定性