方法学验证指导原则(4篇)

本文格式为Word版，下载可任意编辑——方法学验证指导原则(4篇)指导，汉语词语，读音为zhǐdǎo，意思是指示指导、指示引导；指导学生实习，也指体育运动的教练员。出自《汉纪·宣帝纪一》，以下是为大家整理的关于方法学验证指导原则4篇,供大家参考选择。

方法学验证指导原则4篇

第一篇:方法学验证指导原则

溶剂残留方法学验证

溶剂残留检查多采用气相色谱法。一般认为残留溶剂测定属限度检查,按相关指导原则只需提供专属性、检测限、定量限及进样缜密度等方法学研究资料，故未进行线性、确切度和耐用性方面研究。残留量检考究竟是属于定量还是限度检查的范畴，《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》中未明确规定。考虑到药物合成状况对比繁杂，根据所使用的有机溶剂种类、数量等的不同，残留溶剂研究需要进行的程度、目标也可能不同，对方法学的要求也可能随之不同。当检测结果明显低于规定限度时,

寻常按限度检查要求，无需得出确切含量；当检测结果明显高于规定限度（特别当检测结果为限度边缘时），或需残留溶剂量进行含量纯度折算时，需按定量检查要求进行方法学研究。

一、系统适用性试验

取对照品溶液，进样，记录色谱图。

柱效：以被测物的色谱峰计，填充柱法的理论板数应大于1000，毛细管色

谱柱的理论板数应大于5000。

分开度：色谱图中被测物色谱峰与其相邻色谱峰的分开度应大于1.5。

重复性：以内标法测定时，对照品溶液连续进样5次，所得被测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差(RSD)应不大于5%；以外标法测定时，所得被测物峰面积的相对标准偏差(RSD)应不大于10%。

二、专属性

1、对各种残留溶剂定位和进行混合溶剂的分开度试验，并附代表性图谱。

取各种残留溶剂对照品溶液，分别单独进样，记录色谱图。

取混合溶液，进样，记录色谱图。

2、排除供试品中的未知杂质或其挥发性热降解产物对残留溶剂的测定产生的干扰。

①假如未知杂质或其挥发性热降解产物与被测物的保存值一致（共出峰），寻常采用在另一种极性相反的色谱柱系统中对一致样品进行测定，对比不同色谱系统的测定结果的方法。如二者结果一致，则可以排除测定中有共出峰的干扰；如二者结果不一致，则说明测定中有共出峰的干扰。

②热降解产物与被测物的结构一致（如甲氧基热裂解产生甲醇），寻常要通过测定已知不含该溶剂的对照样品来加以判断。

三、检测限和定量限

检测限为信噪比3:1时相应浓度或注入仪器的量。定量测定时需验证定量限，其限度为信噪比10:1时相应浓度或注入仪器的量。同时说明测试的过程和结果，并附图谱。

四、线性

制备6个浓度，R=0.9990。附回归方程、相关系数和线性图。

线性溶液浓度应从定量限浓度开始，至对照溶液浓度的120%以上。

五、缜密度

1、重复性

①在规定范围内，至少9个测定结果。设计三个不同的浓度进行测定。一般保存时间的RSD〈1%，峰面积的RSD〈5%。

②以内标法测定时，对照品溶液连续进样6次，所得被测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差(RSD)应不大于5%；以外标法测定时，所得被测物峰面积的相对标准偏差(RSD)应不大于10%。保存时间的RSD〈1%。

2、重现性

指不同试验室之间不同分析人员测定结果的缜密度。

当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。

六、确切度

在规定的范围内，至少9个测定结果。设计三个不同的浓度进行测定，计算回收率和相对标准偏差，含量测定的回收率应大于98%。

进行回收率试验时，由于采用顶空进样系统，供试品与对照品处于不完全一致的基质中，此时应考虑气-液平衡过程中的基质效应。

标准参与法可以消除供试品液基质与对照品溶液基质不同所致的基质效应的影响，故寻常采用标准参与法验证定量方法的确切性。当标准参与法与其它定量方法的结果不一致时，应以标准参与法的结果为准。

标准参与法为缜密称（量）取被测定的残留溶剂对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量缜密参与到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定残留留剂的含量，再扣除参与的对照品溶液的含量，即得供试液溶液中残留溶剂的含量；或按下式计算残留溶剂的量。Cx=ΔCx/[（Ais/Ax）-1]，式中Cx为供试品中组分X的浓度；Ax为供试品中组分X的色谱峰面积；ΔCx为所参与的已知浓度的被测组分对照品；Ais为参与对照品后组分X的色谱峰面积。

标准参与法测回收率

步骤1

缜密称量适量的药粉，定容置100m容量瓶中，缜密量取5ml分别置5个10ml容量瓶中，各瓶中分别参与梯度的标样，定容，分别测量各个瓶中的样品，可以得到x1。

请计算好

样品量

和标样的浓度！可以根据以前的数据算好！

步骤2

原理同步骤1。缜密称量适量的药粉，量相当于步骤1的一半，定量参与标样C，量和该步骤中称取的药粉中含被测物的量相当，再定容置100ml容量瓶中，以下步骤同步骤1。。。。。。

得到

x2

回收率的计算要繁杂一些，根据第一步是可以得到粉中被分析物的含量的。

其次步骤中药粉中被测物的含量要利用第一步中的含量和取样量来计算！C是理论参与的量，根据

x1

和

x2

可以算出测量的参与量

c‘回收率

＝

c’/C

*100%

以上方法要求药粉的溶解度十分好！可能更可行的方法如下：

缜密称取药粉适量，定容置

25

ml

量瓶中，缜密量取

溶液

2ml

，分别参与5

个顶空瓶中，在该顶空瓶中参与0.2，

0.4，

0.6，

0.8，

1.0

ml

的标样，再补足溶剂，使各瓶的体积相等。

用校正过的加样枪

完成以上步骤！

七、耐用性

气相色谱法中耐用性包括：载气及流速，不同厂牌或批号的色谱柱、固定相、担体，柱温、进样口和检测器温度改变，分流比调整等。资料中需说明小的变动

能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。

前我一般的制定有机残留,操作是先看药典附录VIIIP,那个表,根据上面的限度.来设计.样品尽量多称点.浓度配高点..根据那个限度.来推算对照品溶液的浓度..尽量多称对照品,由于有机挥发快,再称样过程中会影响称量.譬如甲醇限度是0.3%,计划1g样品(具体根据溶解性来做)用溶解性很高的溶剂定容到10ml,那么根据限度换算,对照品需要配置0.3mg/ml浓度.称对照品,最好先再容量瓶中装一些溶剂.称样.滴定管悬空滴加.便利称量.

溶剂的选择，应根据原料药溶解性，选择低毒性，且与待测的残留组分分开好（事先可以参考沸点和柱子初步判断）。

我觉得应当从以下几点去做好残留溶剂检查，并应从以下几个方面展开探讨一.首先应学习和熟练把握中国药典2022年版二部附录ⅧP残留溶剂测定法的有关要求；主要是以下几点：1.色谱柱的选择，一般现在都要选择毛细管柱，假如你们公司很有条件，那么极性和非极性的色谱柱都购买吧！我们用的是中极性的色谱柱，一般做有机溶剂残留大多数是可以了。2.供试品溶液的制备，主要是根据供试品的溶解度来选择，同时也要考虑对照品在该溶剂中的溶解性。一般首先选择溶剂水、DMF、DMSO，再考虑其它溶剂。3.测定法的选择，等温柔程序升温法，进样方面主要有顶空和直接进样法，这个主要根据自身实际条件来选择。4.其它就不多说了，主要看一下该残留溶剂测定法后面的，药品中常见的残留溶剂及限度，还有相对保存时间的参考值，这个对实际做某个品种时很有用，可以提前大约知道该残留溶剂的保存时间。二、残留溶剂检查方法的选择和验证要点（姜连阁），这个很有用1.概述药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中，以及制剂制备过程中使用的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。按有机溶剂的毒性和对环境的危害，ICH将有机溶剂分为避免使用、限制使用、低毒和毒性依据尚不足四种状况。因残留溶剂会影响产品的安全性，故需对其进行研究。2.残留溶剂检查方法的选择残留溶剂的测定一般采用气相色谱法，推荐使用毛细管色谱柱-顶空进样系统，当然也可以使用普通填充柱，溶液直接进样方法。对不宜采用气相色谱法测定的含氮碱性化合物，如N-甲基吡咯烷酮等可采用其它方法，如离子色谱法等。测定残留溶剂应从以下几个方面考虑：确定被测的有机溶剂、选择适合的色谱柱、制备供试品溶液和对照品溶液、选择适合的进样方法和满足检测灵敏度要求的检测器，下面分别进行介绍：2.1、确定被测的有机溶剂根据制备工艺确定被测有机溶剂的范围。寻常应对制备工艺过程中使用的二类以上溶剂和重结晶用溶剂，以及根据工艺特点要求的其它溶剂进行残留量的研究。建议对合成最终三步使用的三类溶剂也进行研究，这样能更好地对未知峰进行归属；对制剂过程中使用的有机溶剂也建议考察其残留状况，特别是缓、控释微丸包衣过程使用的有机溶剂更应引起注意。残留溶剂的限度要求同ICH的规定。2.2、选择适合的色谱柱依照相像相溶的原理选择色谱柱。毛细管柱有极性柱、非极性柱、弱极性柱和中等极性柱。填充柱有高分子多孔小球或涂渍适合固定液的填充柱。测定含氮的碱性有机溶剂时，由于普通气相色谱仪的不锈钢管路、进样器衬管等对有机胺等含氮的碱性化合物具有较强的吸附作用，致使其检出的灵敏度降低。寻常采用弱极性色谱柱或经碱处理过的色谱柱分析含氮的碱性有机溶剂，假如采用胺分析专用柱进行分析，则效果更好。2.3、供试品和对照品的制备顶空进样方法寻常以水为溶剂，对于非水溶性的药物，可采用DMF、DMSO或其他适合溶剂。溶液直接进样方法用水或适合的溶剂溶解样品。制备供试品的溶剂的选择应兼顾供试品和被测有机溶剂的溶解度，且所用溶剂应不干扰被测有机溶剂的测定。水是首选溶剂，特别是顶空进样系统。由于水中不含有机溶剂，故干扰较少，且在FID检测器上，以水为溶剂时，各残留溶剂的灵敏度最高。当药物不溶于水时，可参与适当的酸或碱以增加药物的溶解度，最好选用不挥发的酸或碱。以DMSO等为溶剂时，可参与一定量的水以增加检测的灵敏度，或用盐析的方法增加灵敏度。测定含氮的碱性溶剂时，供试品溶液应不呈酸性，以免被测物与酸反应后不易汽化。对照品的制备方法应与供试品的制备方法一致。在申报资料中发现对照品（溶液）为直接进样，供试品则为固体直接顶空进样，供试品和对照品不但制备方法不同，而且进样方法和进样量也不同，无法进行对比。提请申报单位注意。2.4、供试品溶液和对照品溶液浓度的确定配制供试品溶液的浓度应满足定量测定的需要，一般供试品取样量在0.1～1g之间。限度检查时对照品溶液的浓度可按规定的限度配制，定量测定时按实际残留量配制，浓度相差最好以不超过2倍为宜。2.5、检测器的选择一般选用FID检测器，对含卤素的有机溶剂如氯仿等，采用ECD检测器可得到更高的灵敏度。寻常可根据药物溶剂的残留状况选择适合的检查方法。当需要检查的有机溶剂数量不多，且极性差异较小时，可选择毛细管色谱柱-顶空进样-等温法。当需要检查的有机溶剂数量较多，且极性、沸点差异较大时，可选择毛细管色谱柱-顶空进样-程序升温法；也可选择填充柱或适合极性的毛细管柱直接进样法。限度检查（一类、部分二类溶剂）时采用内标法或外标法；定量测定（含量超过0.1%的二类或需要定量操纵的三类溶剂）时采用内标法或标准参与法。顶空进样法还要对顶空温度和顶空时间进行选择。顶空温度应根据溶解供试品溶剂的特性及供试品中残留溶剂的沸点选择。以水为溶剂及测定低沸点残留溶剂时，顶空温度不宜超过85℃；测定沸点较高的残留溶剂时，寻常选择较高的顶空温度；但此时应兼顾供试品的热分解特性，尽量避免供试品产生的挥发性热分解产物干扰测定结果。以DMSO为溶剂时，顶空温度不宜超过115℃。例如，在申报资料中发现，以水为溶剂，顶空温度为100℃，柱温60℃，结果高浓度的乙腈比低浓度的二氯甲烷的峰面积还小，原因是顶空温度太高，大量的水被蒸发（或浓度被稀释），随着水蒸汽的凝聚，在水中溶解度大的乙腈的灵敏度下降，产生了与事实不符的试验结果。顶空时间是要确保供试品溶液的气-液两相达到平衡，一般通过测定顶空时间与顶空气体浓度的浓度—时间曲线来确定。顶空时间不宜过长，一般为30～45分钟，假如超过60min，可能引起顶空瓶的气密性变差,导致定量的确切性降低。假如平衡时间选择10分钟，就不能保证气-液两相达到平衡。注意对照品溶液与供试品溶液必需使用一致的顶空条件。甲酰胺、2－甲氧基乙醇、2－乙氧基乙醇、乙二醇、N-甲基吡咯烷酮等不适合用顶空法测定。3、残留溶剂检查方法的验证（我认为必做用红色标识）

3.1、系统适用性试验柱效：用被测物的色谱峰计算，填充柱法的理论板数应大于1000，毛细管色谱柱的理论板数应大于5000。分开度：色谱图中被测物色谱峰与其相邻色谱峰的分开度应大于1.5。重复性：以内标法测定时，对照品溶液连续进样5次，所得被测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差(RSD)应不大于5%；以外标法测定时，所得被测物峰面积的相对标准偏差(RSD)应不大于10%。3.2、确切度在规定的范围内，至少9个测定结果。设计三个不同的浓度进行测定，计算回收率和相对标准偏差，含量测定的回收率应大于98%。进行回收率试验时，由于采用顶空进样系统，供试品与对照品处于不完全一致的基质中，此时应考虑气-液平衡过程中的基质效应。标准参与法可以消除供试品溶液基质与对照品溶液基质不同所致的基质效应的影响，故寻常采用标准参与法验证定量方法的确切性。当标准参与法与其它定量方法的结果不一致时，应以标准参与法的结果为准。标准参与法为缜密称（量）取被测定的残留溶剂对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量缜密参与到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定残留留剂的含量，再扣除参与的对照品溶液的含量，即得供试液溶液中残留溶剂的含量；或按下式计算残留溶剂的量。Cx=ΔCx/[（Ais/Ax）-1]，式中Cx为供试品中组分X的浓度；Ax为供试品中组分X的色谱峰面积；ΔCx为所参与的已知浓度的被测组分对照品；Ais为参与对照品后组分X的色谱峰面积。3.3、专属性对各种残留溶剂定位和进行混合溶剂的分开度试验，并附代表性图谱。供试品中的未知杂质或其挥发性热降解产物易对残留溶剂的测定产生干扰。假如未知杂质或其挥发性热降解产物与被测物的保存值一致（共出峰），或热降解产物与被测物的结构一致（如甲氧基热裂解产生甲醇）时，应通过试验排除干扰。对第一类干扰，寻常采用在另一种极性相反的色谱柱系统中对一致样品进行测定，对比不同色谱系统的测定结果的方法。如二者结果一致，则可以排除测定中有共出峰的干扰；如二者结果不一致，则说明测定中有共出峰的干扰。对其次类干扰，寻常要通过测定已知不含该溶剂的对照样品来加以判断。3.4、其它可根据是限度检查还是定量测定选择具体的验证内容。缜密度：重复性和重现性，在规定范围内，至少9个测定结果。设计三个不同的浓度进行测定。一般保存时间的RSD〈1%，峰面积的RSD〈5%。线性：至少制备5个浓度，R=0.99。附回归方程、相关系数和线性图。检测限和定量限：检测限为信噪比3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量。定量测定时需验证定量限，其限度为信噪比10:1时相应浓度或注入仪器的量。同时说明测试的过程和结果，并附图谱。

其次篇:方法学验证指导原则

***方法学验证步骤

一、试验目的：对方法的线性、缜密度、重复性、稳定性、加样回收率进行考察。

二、试验方案：中药质量标准分析方法验证指导原则

三、样品来源：金振口服液170101Z

四、色谱条件：

色谱柱：watersc18250*4.6mm

滚动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（45:55）

流速：1ml/min

检测波长：278nm

进样量：10ul

五、试验过程：

5.1线性关系考察

①储存液制备：缜密称取黄芩苷对照品6mg置于50ml容量瓶中，用甲醇定容。作为母液。

②制备不同梯度标准系列溶液：

③每份对照品溶液进样2针，算出平均峰面积，再计算回归方程。

5.2缜密度考察

供试品制备：缜密吸取对照品溶液-母液，连续重复进样6次，(可以和线性一个序列，再跑4针，共6针。都命名d6)测得峰面积，计算rsd值。

5.3稳定性考察

取5.4项下重复性考察样品180609,在0、2、4、6、8、10、12h各进样一次。命名都是170101z-1测得峰面积。计算rsd值。

5.4重复性考察

供试品制备：取180609批样品，缜密量取5ml，置50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。共平行制备6份供试品。命名170101z-1,170101z-2,170101-3,170101z-4，170101-5,170101z-6。每份样品进样2针。对照品浓度40ug/ml配置平行样DZ1，DZ2.共进5针。，算出含量。计算rsd值。

重复性插在稳定性里面跑。

5.5加样回收率

缜密量取170101z样品（譬如：样品含量0.58mg/ml）2.5ml，置50ml容量瓶中，参与黄芩苷含量为0.29mg/ml对照品溶液1ml。定容至50ml。共制备6份。每份样品进样2针。对照品浓度40ug/ml配置平行样DZ1，DZ2共进5针，算出样品含量。命名yp1，yp2，yp3，yp4，yp5，yp6。

第三篇:方法学验证指导原则

一、方法验证

1．确切度该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值对比，计算回收率。可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。

2．线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。

3．缜密度1）重复性配制6份一致浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能一致的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。2）中间缜密度配制6份一致浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。

4．专属性可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分开，分开度不得小于2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。

5．检测限主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。

6．定量限主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保存时间的相对标准差应不大于2.0%。

7．耐用性分别考察滚动相比例变化±5％、滚动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必需达到基线分开；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%。

8、系统适应性配制6份一致浓度的供试品溶液进行分析，主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主峰保存时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必需达到基线分开，主峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。

二、分析方法验证（Validation）

进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。从本质上讲，方法验证就是根据检测工程的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法符合检测工程的要求。方法验证在质量操纵上有重要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是制订质量标准的基础。方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、确切度、缜密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不尽一致。

1.专属性（Speciality/Specificity）

专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为“选择性〞。对于纯度检测，可在标准品中参与产品中的已知杂质，或者直接用粗品，考察产品峰是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪，可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。一般要求产品和杂质之间的分开度大于2.0。

2.线性（Linearity）

线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原料或产品的浓度呈线性关系的程度。线性是定量检测的基础，需要定量检测的工程都需要验证线性。一般用贮备液经过缜密稀释，或分别缜密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5个以上），按浓度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归计算，考察分析方法的线性。

3.范围（Range）

范围指在能够达到一定的确切度、缜密度和线性时，样品中被分析物的浓度区间。简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度最大值和最小值。需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80％～120％。

4.准确度（Accuracy）

确切度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做“真实度〞，需要定量得分析方法均需要验证确切度。确切度应在规定的范围内建立，对于原料药可用已知纯度的标准品或符合要求的原料药进行测定，必要时可与另一个已建立确切度的方法对比结果。

5.精密度（Precision）

缜密度是指在规定条件下，同一均匀样品经屡屡取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度。缜密度一般用相对标准偏差（RSD）表示，取样检测次数应至少6次。缜密度可以从三个层次考察：重复性、中间缜密度、重现性。

a、重复性（Repeatability）：是在一致的操作条件下、较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的缜密度。一般是用100％浓度水平的样品测定6次的结果进行评价。

b、中间缜密度（Intermediateprecision）：同一试验室，在日期、分析人员、仪器等内部条件改变时，测定结果的缜密度。

c、重现性（Reproducibility）：指不同试验室之间不同分析人员测定结果的缜密度。

6.检出限（LimitsofDetection；LOD）

检出限是指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，不需要确切定量。检出限表达了分析方法的灵敏度。检出限的测定可以通过对一系列已知浓度被测物的试样进行检测，以能确切、可靠检出被测物的最小浓度来确定，也可把已知浓度样品的信号与噪声信号进行对比，以信噪比为3：1时的浓度确定检出限，一般要求能够达到进样浓度的0.05%。

7.定量限（LimitsofQuantitation/Quantification；LOQ）

定量限是指样品中的被分析物能够被定量检测的最低量，其测定结果需要一定的确切度和缜密度，定量限表达了分析方法灵敏定量检测的能力。检测需要严格操纵含量的杂质，必需考察方法的定量限，以保证杂质能够被确切定量。一般以信噪比为10：1时相应的浓度或进样量来确定定量限。

8.耐用性（Durability/Robustness）

耐用性是指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，耐用性主要说明方法的抗干扰能力，主要的变动因素包括：滚动相的组成、流速和pH值、色谱柱、柱温等。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。

9.系统适用性试验（SystemSuitability）

液相色谱分析方法主要依靠高效液相色谱仪和色谱柱，在做方法验证时，有必要将高效液相色谱仪、色谱柱、滚动相与试验操作、待测样品等一起当作完整的系统进行评估，并将系统适用性作为分析方法的组成部分，系统适用性便是对整个系统进行评估的指标。

一般系统适应性的要求为：分析方法能够达到0.05%的检出限；主峰的拖尾因子（T）0.95第四篇:方法学验证指导原则

目的：建立分析方法学验证的指导程序，用以证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，保证验证工作能够有计划、按步骤的进行，同时使与质量检验有关的活动符合GMP的要求。

范围：适用于本公司所有的分析方法的验证的活动。

职责：QC：负责起草分析方法验证的验证方案、报告；负责按批准的验证方案执行验证；负责检验仪器运行和保养。

QA：负责确定分析方法的验证条件、标准、限度及检验方法；负责验证方案、报告的审核；QA负责人负责方案、报告的批准。

1相关定义

分析方法：法是为完成检验工程而设定和建立的测试方法，它详细描述了完成分析检验的每一步骤。一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、供试品溶液与对照品溶液的制备，测定，计算公式及检测限度等。

方法验证：方法验证就是根据检验工程的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法是否符合检验工程的要求。在建立产品质量标准时，分析方法需经验证。

方法确认：在应用已验证的药典方法和其他法定方法前，应在当前的试验室条件下进行方法确认来证明方法在该试验室的适用性。

2验证的适用范围

产品的物料、中间产品、中间过程操纵和产品的理化分析方法的验证和确认；

清洁验证方法的验证。

3需要验证的分析工程

根据检验工程的设定目的和验证内容的不同要求，将需验证的检验工程分为四类：

鉴别试验；鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其它物质。用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性和耐用性。

杂质的限度检查与定量测定；杂质检查主要用于操纵主成分以外的杂质，如无机杂质，有机杂质等。杂质检查分为限度检查和定量测定两部分。用于限度检查的分析方法验证侧重专属性、检测限和耐用性。用于定量测定的分析方法验证强调专属性、确切度、缜密度、线性、范围、定量限和耐用性。

含量测定；含量测定对确切度要求较高，因此所采用的分析方法要求具有一定的专属性、确切度和线性等。

除此之外还有一些物理工程的检测如粒径分布、旋光度、熔点和硬度，其要求与其它检验工程有所不同，寻常在进行分析方法验证应有不同的要求。

《中国药典》2022版关于不同的检验工程需要验证不同的内容：

工程

内容

鉴别试验

杂质测定

含量测定

定量

限度

确切度

－

+

－

+

缜密度

重复性

－

+

－

+

中间缜密度

－

+①

－

+①

专属性②

+

+

+

+

检测限（LOD）

－

－③

+

－

定量限（LOQ）

－

+

－

－

线性

－

+

－

+

范围

－

+

－

+

耐用性

+

+

+

+

①已有重现性验证，不需验证中间缜密度；

②如一种方法不够专属，可由其它分析方法予以补充。

③视具体状况予以验证。

4验证内容

确切度

确切度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。一般用回收率表示。确切度应在规定的范围内测试。

验证方法

确切度是定量测定的必要条件，因此含量测定、杂质定量测定均需验证确切度。具体方法如下：

含量测定：可以用已知纯度的对照品或供试品进行测定。也可以用本法所得结果与已知确切度的另一方法测定的结果进行对比。如该分析方法已经测试并求出缜密度、线性和专属性，在确切度也可推算的状况下，确切度可向制可不必再做。

杂质的定量测定：可以向样品中参与已知量杂质进行测定。假如不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行对比，如药典方法或经过验证的方法。在不能测得杂质或降解产物的响应因子或不能测得对原料药的相对响应因子的状况下，可用原料药的响应因子。应明确单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（％）或面积比（％）。

例如：测定含量的确切度,按标示量的80%,100%和120%配制三个浓度的溶液，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。根据测定结果与配制浓度计算出平均回收率以及相对标准偏差。

数据要求：在规定的范围内，至少用9个测定结果进行评价。例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。应报告已知参与量的回收率（％）或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或置信区间。

缜密度

缜密度系指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经屡屡取样测定所得结果之间的接近程度。缜密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

缜密度与确切度的不同在于。缜密度测定了一系列重复性的被分析物之间的接近程度，但它不能表达与已建立的真值之间的符合程度，后者由确切度来测定。通过一系列的测定值，可以得到良好的缜密度，但是由于所用分析方法存在的偏差，所得的平均值不一定与真实值相符，在这种状况下，需要修改方法以消除偏差。

验证方法

缜密度可从重复性、中间缜密度、重现性三个层次考察。

重复性：在一致条件下，由同一个分析人员测定所得结果的缜密度称为重复性。

在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价。例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定3次，或将相当于100％的浓度水平的供试品溶液，用至少测定6次的结果进行评价。

中间缜密度：在同一个试验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的缜密度，称为中间缜密度。

为考察随机变动因素对缜密度的影响，应设计方案进行中间缜密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。

重现性：在不同试验室之间由不同分析人员测定结果之间的缜密度，称为重现性。

法定标准采用的分析方法或在不同试验室之间进行方法转移时，应进行重现性试验。例如建立药典分析方法时，通过协同检验得出重现性结果。协同检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中，应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输。

数据要求：均应报告标准差、相对标准偏差（变异系数）和置信区间。

专属性

专属性系指在其他成分(如：杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。寻常,鉴别反应、杂质检查、含量测定均应考察其专属性。如一种方法不够专属，可由其它分析方法予以补充。

验证方法

鉴别试验：用于确认被测成分符合其特征。专属性要求证明其能与可能共存的物质或结构相像化合物区分。

含被测成分的供试品呈正反应，而不含被测成分的供试品以及结构相像或组分中的有关化合物，应均呈负反应。

对于药品，辅料不得干扰其有效成分的鉴别。

含量测定和杂质测定：色谱法和其他分开方法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明诸成分在图中的位置，色谱法的分开度应符合要求。

在杂质可获得的状况下，对于含量测定，可向试样中参与杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样对比测定结果。对于杂质测定，也可向试样中参与一定量的杂质，考察杂质与共存物质能得到分开和检出，并具有适当的确切度与缜密度。

在杂质或降解产物不能获得的状况下，专属性可通过测定含有杂质或降解产物的试样，与另一个已验证的方法或药典方法对比结果。或对试样用强光照射，高温，高湿，酸（碱）水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解产物和降解途径。对于含量测定应比较二法测定的结果。杂质检查应比对破坏前后检出的杂质个数。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测进行峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。

检测限（DL）

检测限系指试样中的被分析物能够被检测出的最低量。鉴别试验和杂质测定，均应通过测试确定方法的检测限。

验证方法

非仪器分析目视法：用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

信噪比法：用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行对比，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3：1或2：1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

除信噪比法外，还可根据响应因子的标准偏差和斜率计算出检测限。

LOD=

式中：为响应值的标准差；

S为校正曲线的斜率，S=m。

斜率S可以通过样品的校正曲线来估算。

的值可以由以下途径估算。例如：根据空白的标准差（通过几份空白样品的分析，然后计算其响应值的标准差，测出分析背景响应值的大小），根据校正曲线（通过对含有检测限范围内被分析物样品的分析来研究其标准曲线，回归线的剩余标准差或回归线的y轴截距标准差都可以作为标准差）。

数据要求：应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。

定量限（QL）

定量限系指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的确切度和缜密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定方法的定量限。

验证方法

常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比为10：1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

除信噪比法外，还可根据响应因子的标准偏差和斜率计算出定量限。

LOD=

式中：为响应值的标准差（通过空白样品测背景响应值或Y轴截距）；

S为校正曲线的斜率（通过样品的校正曲线求得），S=m。

斜率S可以通过样品的校正曲线来估算。

的值可以由以下途径估算。例如：根据空白的标准差（通过几份空白样品的分析，然后计算其响应值的标准差，测出分析背景响应值的大小），根据校正曲线（通过对含有定量限范围内被分析物样品的分析来研究其标准曲线，回归线的剩余标准差或回归线的y轴截距标准差都可以作为标准差）。

线性

线性系指在设计的测定范围内，检测结果与试样中被测物的浓度直接呈正比关系的程度。

线性是定量测定的基础，涉及定量测定的工程，如杂质定量测定和含量测定均需验证线性。

验证方法

应在设计的测定范围内测定线性关系。可用一贮备液经缜密稀释，或分别缜密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5个浓度的供试样品。每一个浓度的样品3份，以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观测是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。

数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。

范围

范围系指能够达到一定的缜密度、确切度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。

范围应根据分析方法的具体应用和线性、确切度、缜密度结果和要求确定。含量测定需涵盖的最低浓度范围至少为标示量的80-120%(ICH)，推荐包含50%-150%的浓度。杂质的定量测定，范围应根据初步实测，拟订为规定限度的±20%。假如含量测定与杂质检查同时进行，用百分归一化法，则范围应为杂质规定限度的-20%至含量限度（或上限）的+20%。推荐包含LOQ－规定限度的＋20%。

耐用性

耐用性系指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。假如通过耐用性研究发现分析方法对某个或某些测试条件敏感或要求苛刻，建议在方法中予以写明。

典型影响耐用性的变动因素包括：被测溶液的稳