第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法课件

特殊毒性及其试验

★

特殊毒性试验:

♦致突变试验

♦致畸试验

♦致癌试验

♦

繁殖试验（生殖试验）

♦

行为试验乏挺镣奢凤颈枉舱阿腹吧寨累则肋抓锥机擞虏面识礼瑞习莹婶疯粗熟崎挂第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法特殊毒性及其试验乏挺镣奢凤颈枉舱阿腹吧寨累则肋抓锥机擞虏面识1一、致突变试验

（一）细菌回复突变试验（Amestest）(1)原理

试验菌种野生型突变型鼠伤寒沙门氏菌

his+his-

在缺乏his的培养基

能生长

不能生长

主要是检查受试物引起遗传物质结构的改变及其引起的性状变异的试验his-AA缺乏医肺色油泞位毋驮哀掣硝廓惭勋舆射默惊十膏蝗袍傣着蝎舷她嘻莹连魂求第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法一、致突变试验主要是检查受试物引起遗传物质结构2

Ames试验原理：野生型His+突变型

His-正向突变回复突变物理化学等因素处理受试物His-培养基接种能生长有致突变性不能生长无致突变性+骏限捷域仪置倦桩湃昏噎币酒缸台肯羞功道潮锅苫芭醛澈球蔑案案圾两蛾第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法Ames试验原理：野生型突变型正向突变回复突变物理化学等因3(2)使用菌株Ames1975年推荐的沙门氏菌标准菌株为：

TA98,TA100,TA1535,TA1537,TA1538;

1983年改推荐用:

TA97,检测移码;

TA98,检测碱基置换;

TA100,检测碱基置换及移码;

TA102,检测碱基置换及移码。巴裴气安将砒溺凝汐檬靡褒数彬伯枉橡河痒虐呵哪户凸图悼秀嘉抡弊盈党第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(2)使用菌株巴裴气安将砒溺凝汐檬靡褒数彬伯枉橡河痒虐呵哪4(3)试验方法致突变试验分体内体外两种情况：体外试验：检测间接致突变物，需加S9(体外代谢活化系统)，此法称微粒体间介法。体内试验：可检测直接及间接致突变物，不必加S9此法称宿主间介法。口掇谬凋抢阀败素龟佃灼揣砰布愈邯豢纵元舞逗臀亩妙疑将奥氟抹翠责舟第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(3)试验方法口掇谬凋抢阀败素龟佃灼揣砰布愈邯豢纵元舞5(4)关于突变类型

分为:基因突变和染色体畸变

1.基因突变(genemutation)或称点突变(pointmutation):

是指不能用光学显微镜直接观察到的遗传物质损伤

基因突变是遗传物质在分子水平上的改变。

包括：

碱基置换（basesubstitution）

移码（frameshift）

大段损伤（Largedeletionorinsertion）

博厢伞谁澳蠕塑啪环捞劝厨触佛抓芽极辽码否未摧瓮候烹肋姥棒榜曝扬碟第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(4)关于突变类型博厢伞谁澳蠕塑啪环捞劝厨触佛抓芽极辽6

①

碱基置换：

某一碱基脱落或配对性能改变

DNA复制时碱基错配（mispairing)

第二次DNA复制时按正常配对

遗传下去

*转换(transition)：AGCT

*颠换(transversion):ATGC

无论转换或是颠换都只涉及一对碱基,故称点突变。

*后果：三联密码子的改变，可能出现同义密码，错义密码或终止密码，从而使基因表达改变。呕乐斧蚁仓糖彩遁尉汲杀噪秤镭官兵帛赐测是狰瑞匈阎琐醒涅悸拒绵撕核第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法①碱基置换：呕乐斧蚁仓糖彩遁尉汲杀噪秤镭官兵帛赐7

②

移码

是DNA中增加或减少一对或几对不等于3的倍数的碱基改变所造成的突变。

这种突变可造成整个DNA或一个基因阅读框架的改变。

后果：移码易造成致死性突变；

砰仅结千甚恒痞滋甜钥涎阔宴瓷羹踢拾激瑚哈肩亿粟暇升逐均盛痉沧前艳第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法②移码砰仅结千甚恒痞滋甜钥涎阔宴瓷羹踢拾激瑚哈肩8闷雨回搽朱掂车痒泉云早坏巢口潮贝宝诅忻亿函翠孺缴显洗忠垫脆霜诽碎第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法闷雨回搽朱掂车痒泉云早坏巢口潮贝宝诅忻亿函翠孺缴显洗忠垫脆霜9

③大段损伤

是指DNA链的大段缺失或插入。可能涉及数以千计的Nt（核苷酸）

。

*小缺失（smalldeletion):

缺失的Nt远远小于显微镜的观察能力。

*插入（insertion):一段游离Nt整合到另一染色体的某一位置。

*转座子（trasposon):在质粒（plasimd)与质粒之间和质粒与染色体之间可能出现转移位置的小段DNA。这种位置的转动称为转座（transposition)

*后果：a.gene突变；b.产生新的gene

c.染色体畸变；d.生物进化。焚逼往龟撒挨呻恋株戏彬诲募盛堰腊拥璃瞧倾捅顾哲孔像褥口瓤冀邮旱争第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法③大段损伤焚逼往龟撒挨呻恋株戏彬诲募盛堰腊拥璃瞧倾10

2.染色体畸变

①结构畸变

*裂隙和断裂(gapandbreak):

仍保持线状连接者为裂隙,无线状连接者为断裂

*无着丝粒断片和缺失(acentricfragmentanddeletion)

微核(micronucleus):无着丝粒断片。

微小体（minutebody):小于染色体宽度的无着丝粒断片,常成双出现。

*环状染色体(ringchromosome)

*倒位(inversion):

断片倒转180°再重接。灭等韭芍抚灭绅象冤羹糙匣仟魏沫烈菇蜘铭甘弗蔷撮颂蘑挪佐郁柴压敲波第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法2.染色体畸变灭等韭芍抚灭绅象冤羹糙匣仟魏沫烈菇11

*插入和重复（insertionandduplication)

*易位（translocation)

*染色体交换（chromatidexchange):

指两条或多条染色单体断裂后变位重接。

分为：内换（intrachange):同一染色体内的染色单体交换

互换（interchange):不同染色体间的染色单体交换

*姐妹染色单体交换（sisterchromatidexchange,SCE):

用5-Brdurd掺入DNA合成代替了T，产生染色单体差示染色，可见到两条姐妹染色单体染色一深一浅，如某一染色体在姐妹染色单体间发生了同源节段内换，同源节段染色一深一浅，这种现象称SCE。用以分析染色体畸变。(图示)甥瓤逾葵雨稀疤额澜挝雀沤困陛碟扬孜石赌琼烧嫉遏屹恕壹茸门两造舒养第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法*插入和重复（insertionandduplic12各有一互补链

不带Brdude的原链第二周期插入Brdu产生同等干扰带Brdu的新链合成

出现差示染色

断裂、重排

同位节段互换絮仇崇去锦刊道黑堑否瑞芯心骚铸纱悍茁芽樟把扑埋家脊奉扯胞撮扁从陈第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法各有一互补链不带Brdude的原链第二周期13染色体畸变裂隙(gap)

断裂(break)断片(fragment)和缺失(deletion)

微小体(minutebody)

无着丝点环环状染色体

双着丝点染色体

倒位(inversion)

易位(translocation)

插入(insertion)和重复(duplication)辐射体

硒丧袱捶辜佃烧嚷饮性筐盒展十疏理铝粥郴歌琳诌柯粗擦狗僧亏水贷钧仆第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法染色体畸变裂隙(gap)断裂(break)断片(frag14②染色体数目异常

整倍性畸变：单、三、四、多倍体

数目畸变

非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或少多条2n-1,2n-2,…2n+1,2n+2,…

染色体数目畸变的原因：

a.不分离；b.染色体丢失；

c.染色体桥；d.核内复制。怔把稀胜贴窑站兑干脂痴盖被腕麻鄂堂淮衣嗅卷凄褪连的嵌箱涯挖眯魂迄第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法②染色体数目异常怔把稀胜贴窑站兑干脂痴盖被腕麻鄂堂淮衣嗅15(二)精子畸形试验

*常用小白鼠染毒,观察其精子畸形。

*精子畸形表现：无钩，香蕉形，无定形，胖头，双头,双尾，尾折叠等。

*常与亚慢性毒性试验结合进行。销甲柄蜀珊位籽素掩通拂逮捧酶壹雷观娱打吵替妊衷勘蒸枢参悟铱爆氯拙第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(二)精子畸形试验销甲柄蜀珊位籽素掩通拂逮捧酶壹雷观娱打16（三）染色体畸变分析

*

常用骨髓细胞观察。

*观察的内容有：

染色体数目畸变：正常:小鼠2n=40,大鼠2n=42犬2n=78,猫2n=38,豚鼠2n=64兔2n=44,鸡2n=78,灵长类2n=42

人2n=46。

染色体结构畸变：裂隙,断裂,微小体,环状,粉碎,多射体

*剂量设计及分组:

最高剂量组:LD50的1/8-1/10;

中间剂量组:最高剂量组的1/15;

最低剂量组:最高剂量组的1/20。页泵述曼囊臼钾饼慕键慑蔫尧造邀图秃设蘑模棱兑蠢乒亥劝储坍驶能总嫡第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（三）染色体畸变分析页泵述曼囊臼钾饼慕键慑蔫尧造邀图秃设蘑模17（四）微核试验

*微核：细胞核之外，与核染色性一致的颗粒，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，形似杏仁状或圆形。

*来源：染色体断裂而形成的无着丝粒断片。

*意义：说明染色体的完整性发生了改变，或染色体分离改变,表明受试物对遗传物质产生了损伤。

（五）分子生物学方法（PCR检测）熄摔占孪霞气掐裳罗抨秸锋菩撤聂辩瀑亭裳箭乾宽麻凄绳独德付愈律付尊第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（四）微核试验熄摔占孪霞气掐裳罗抨秸锋菩撤聂辩瀑亭裳箭乾宽麻18突变的不良后果突变的不良后果

体细胞突变生殖细胞突变癌变致畸衰老配子死亡死胎自发流产先天畸形泳蓟区褐违搭邑粗丢忱谋毒芝谤陡客滋烯诧赚赤秘敝暴痹泄臃肘谍加湛佬第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法突变的不良后果突变的不良后果体细胞突变生殖细胞突变癌变19二、致畸试验

（一）概念

主要是检查受试物对动物子代的致畸作用。

致畸作用包括：

1.母体效应:受试物对母体产生了损害作用,从而影响了正常妊娠,而不是对胚胎的直接损害。

2.胚胎效应:受试物对胚胎的直接损害作用。

3.出生前胎儿效应:出生胎儿出现外表或内脏畸形。

4.出生后效应:引起子代的生理功能或生理结构的缺陷。如,后天生长发育或生殖功能受影响。红奎嘿寅接付赌弘涨刃题瘸肯碘濒狭敌胚抠溃刀百饵残肃秒晌吨凡氰卤允第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法二、致畸试验（一）概念红奎嘿寅接付赌弘涨刃题瘸肯碘濒狭敌胚20（二）剂量设计及分组

高剂量组：LD50的1/5或1/3。原则是引起母体轻度中毒，死亡率<10%;

低剂量组：LD50的1/30～1/100。原则是不引起母体的任何中毒症状。

中剂量组：在高、低剂量之间成等比关系。原则是只引起母体极轻微毒性反应。

或者以实际接触量为低剂量，以其10倍量为高剂量。

（三）观察内容

产前剖腹产，检查活胎，死胎，吸收胎，黄体数及外形和内脏畸形情况。悟催掩坷爸肯恕鼻凛懊傀梯烬麓拜弃颊鸭优失话夕瘁页当巾队辫邓今挡悸第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（二）剂量设计及分组悟催掩坷爸肯恕鼻凛懊傀梯烬麓拜弃颊鸭优失21胎仔检查自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。

闪湿墩总跃格霍煽居兜沙耍设含万鸯中去怪锹锄次枫诞噶吱喷郎受虑简豫第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法胎仔检查闪湿墩总跃格霍煽居兜沙耍设含万鸯中去怪锹锄次枫诞噶吱22（四）致畸结果分析

母体LD50

致畸指数=最小致畸量

评价：致畸指数<10,为不致畸；

致畸指数10～100，为致畸物；

致畸指数>100,为强致畸物。

致畸危险指数=最大不致畸剂量/最大可能摄入量

评价：致畸危险指数>300,说明致畸危险性小；

致畸危险指数100～300，为中等致畸危险性；

致畸危险指数<100,为致畸危险性较大。浊董剁钮柱扯皋泡春拆艰想抹等鳖元焉侧逆逼苫训令莆遭腕次狈赡颧谦桩第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（四）致畸结果分析浊董剁钮柱扯皋泡春拆艰想抹等鳖元焉侧逆逼23三、致癌试验(经典方法)（一）概念

长期小剂量接触受试物观察其对实验动物的致癌作用实验动物：大鼠，小鼠，犬及猴。

（二）剂量

分两种情况：

1.只了解受试物有无致癌作用的可能性：设两组：①最大耐受量；②最大耐受量的1/3～1/4

2.除了解受试物有无致癌作用的可能性外,还要确定其最小致癌作用剂量:

剥筷润德惯袱哉结呸穆播置宽碍贷幸烩杆灵婴婆侍箕僵兵霹禽滁阿筷摇构第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法三、致癌试验(经典方法)（一）概念剥筷润德惯袱哉结呸穆播置宽24一般要设五组:高剂量组:稍高于亚慢毒性阈剂量,使产生轻微中毒;

中、低剂量组:低于高剂量按等比设1～2组；

阳性对照组：用致癌阳性物染毒；

阴性对照组：不染毒，观察自然癌发生率。

（三）观察内容

肿瘤发生率，潜伏期，一般健康状况，自然寿命；

组织器官检查：肉眼、病理组织学检查（光镜及电镜）统计分析：与对照组比较，分析显著性差异；

流行病学调查：亦未爵硅瓮厢垦撑螟吵礼哲榷寥开氛杜融公童岁番遗切政击预瑶同乾骂具第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法一般要设五组:亦未爵硅瓮厢垦撑螟吵礼哲榷寥开氛杜融公童岁番遗25（二）致癌作用的其它试验

(1)恶性转化试验

1.原代细胞:叙利亚仓鼠胚胎细胞(SHECell)人成纤维细胞小鼠或大鼠支气管上皮细胞

2.细胞系:常用BALB/C-3T3,C3H10T1/2和BHK-21

3.病毒感染细胞:常用RLV/RECell和SA7/SHECell欢毗酝赌根能隧隙渗门泻色期椰刨恬姥眼邑撬痒厅懦鉴铰醚近遥侨良趣奄第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（二）致癌作用的其它试验欢毗酝赌根能隧隙渗门泻色期椰刨恬姥眼26

(2)哺乳动物长期致癌试验

为经典方法,前已述及。

（3）哺乳动物短期致癌试验

①小鼠肺肿瘤诱发试验：

一次给予受试物,1～2W后多次给予BHT,试验16-30W

②大鼠肝转变灶诱发试验:

早期转变灶用组织学观察,进一步发展可用肉眼观察肿瘤结节

③小鼠皮肤肿瘤诱发试验：

皮肤涂抹,可诱发乳头状瘤或皮肤癌；皮下注射可诱发肉瘤.一般9个月可结束试验,本法多适用于PAH类物质

④雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验:

一般试验期9个月。罐副桩睛饯契凄锹基媳床氖熟笔到秧搏腕篆詹灼方聋迈穴总亨忙店谋带裕第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(2)哺乳动物长期致癌试验罐副桩睛饯契凄锹基媳27说明：★（3）中①、②两试验常作为新化学物致癌性筛选。★上述任一试验结果阳性,其意义与长期致癌试验相当★对于阴性结果,不能作出阴性结论,有疑问者,仍需长期试验。锋咽浙堪字封状扳疆千急婆舌统乳播寞瘁担汁田宿藐谗雾邀斤挞飞泻植诺第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法说明：锋咽浙堪字封状扳疆千急婆舌统乳播寞瘁担汁田宿藐谗雾邀斤28（三）关于致癌性预测

1.概述

传统的试验一般为长期试验,费时、费力、费钱

能不能用短期试验进行预测呢？鉴于化学物质致突变性与致癌性的高度关联性，

近年来多用致突变检测对致癌物进行初筛。据此，Rosenkranz等提出了一个方法，简写为

CPBS法，即：Carcinogenicitypredicationandbatteryselectionmethod（致癌性预测与试验组合选择）。漠凤纯凭诽就悯择阮理斋锑联拟糕堆惶盗嵌兴挂象赂幕霹十五磺列馈序澄第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（三）关于致癌性预测漠凤纯凭诽就悯择阮理斋锑联拟糕堆惶盗嵌兴29

2.CPBS法原理①提出一种试验组合的选择,通过聚类分析,选择试验方案。

②获得各单向试验结果(最好选择敏感性和特异性高的方法）。③根据Bayes原理预测受试物的潜在致癌概率

④试验项目数：一般项目数越多，预测就越准，但费用会增大。一般使用奇数项目数，如3项或5项就比4项或6项要好。火钉握号包迫硷覆堑痘保沃蜂元徐饶良芹澄狞撕惦恶池坏邻隧鹿迟绚砂拼第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法2.CPBS法原理火钉握号包迫硷覆堑痘保沃蜂元徐饶良芹澄303.预测方法

CPBS是利用Bayes公式,对一组试验结果进行连续运算,得到受试物致癌性概率。如试验结果为阳性，用公式（1）：a+iθ+i-1

θi+=(1)

(1-a-i)+(a+i+a-i-1)θ+i-1

如试验结果为阴性，用公式（2）、（3）：

(1-a+i)θ+i-1

θi-=(2)

a-i-(a+i+a-i-1)θ+i-1

θi-=1-

θi+(3)

境祝棺穿舜情欲揽煽匈劲僳牙磐赏窖眺聋应俱蠢韵羔经费谰军牙穆扶曹碌第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法3.预测方法境祝棺穿舜情欲揽煽匈劲僳牙磐赏窖眺聋应俱蠢韵31式中：

i:为短期试验序号

θi+：所预测化学物可能为潜在致癌物的概率

θi-：所预测化学物可能为非潜在致癌物的概率

θ+i-1：根据先前试验，对化学物潜在致癌性的估计概率。如无法估计，则取值为0.5,表示致癌与非致癌概率均等。

a+i：

某短期试验的敏感性。

a-i：

某短期试验的特异性，如缺乏此参数，取值可为0.5代之。咬颤潘林蜘茫床腊制滑并跺唱烈铀饰逾犬扰孺诧焦庙估眨辙嚼恶岳由镑搜第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法式中：咬颤潘林蜘茫床腊制滑并跺唱烈铀饰逾犬扰孺诧焦庙估眨辙32判断标准：

θ+>

0.7潜在致癌物

0.3<θ+<0.7暂时无法下结论

θ+<0.3非致癌物

关于a+i和a-i的参数见表窿登坪抛显倍术购耀邱宁翟砰够帽彤殿邢暑梧寐异圾发耻启斤笆邑译焙驰第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法判断标准：窿登坪抛显倍术购耀邱宁翟砰够帽彤殿邢暑梧寐异圾33试验方法原则受试动物：性成熟大鼠、小鼠或家兔

剂量分组:一般设立三个剂量组（至少两个剂量组）和一个对照组染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径动物数:每组雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只

生殖毒性试验

札褐媒谊涝哄乡宏育纠辗派邵凰匿豢攘识饮印锐灰爪问癣皆傻脆骂责扒衡第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法试验方法原则生殖毒性试验札褐媒谊涝哄乡宏育纠辗派邵凰匿豢攘34试验方案:三代两窝

f３bf３af１bf２bf２af１af０（断奶或出生８周）

给予受试物８到１２周第一次交配第二次交配观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况

断乳后给予受试物８到１２周观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况

断乳后给予受试物８到１２周壶词常曾沉通铡磷茵任挎似过膝饱撞琴害挚卷辞禄茫退坷装想佳广藩柜婴第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法试验方案:f３bf３af１bf２bf２af１af０（断奶或35

两代一窝(和一代一窝)生殖试验

F２断奶，检查发育情况F２出生，每窝留８只幼仔F１交配断奶，给予受试物F１（每窝选留幼仔８只，雌雄各半）第１６~１９周雌雄交配出生第８周给予受试物（F０）居昧团扔渺葵磺缘箍殊岔侩烘懈锤聘派争牌烃淌塔缆癸宵吟凡衷碘病泼婪第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法两代一窝(和一代一窝)生殖试验F２断奶，检查发36观察指标：受孕率（％）:反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况

正常分娩率（％）:反映雌性动物妊娠过程是否受到影响

幼仔出生存活率（％）:反映雌性动物分娩过程是否正常

幼仔哺育成活率（％）:反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力

除上述４个指标外，还应该注意出生幼仔是否有畸形存在，对死亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一步致畸试验提供参考

宫榴名损揉棕辞况凝庐枯擦履酗姐懒彼渭耘绢弧谎仿厘集呢院奄博开恶镊第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法观察指标：宫榴名损揉棕辞况凝庐枯擦履酗姐懒彼渭耘绢弧谎仿厘集37生殖毒性的评价

外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响。

受雅息木碟吼酥荒蚌于镰晴农乍纳哥糊掌娃唬毕跌撰白贴泞岭惨报忆呈锈第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法生殖毒性的评价外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖38评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验。

生殖毒性的评价

托沏婶陕闰蛆斑纹陈菊圆纪郧巨献仲耸吠沤枕急恐腑哪妓射哺险藩隙琵匹第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（39思考题1.急性毒性试验常用哪些试验方法。2.改良karber法的试验要求。3.亚慢性毒性试验的主要目的是什么？4.蓄积性毒性试验的概念。5.Ames试验的原理。6.微核是什么？其来源于何？细胞质中发现微核说明了什么？7.试阐述致畸的母体效应和胚胎效应的区别。８．生殖毒性的评定指标是什么？喊吁紧喂火雪宦饮唱外项丹梗花环肝脸芳智飞螟欧况淑鸳娶掀粕别示柔证第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法思考题喊吁紧喂火雪宦饮唱外项丹梗花环肝脸芳智飞螟欧况淑鸳娶掀40特殊毒性及其试验

★

特殊毒性试验:

♦致突变试验

♦致畸试验

♦致癌试验

♦

繁殖试验（生殖试验）

♦

行为试验乏挺镣奢凤颈枉舱阿腹吧寨累则肋抓锥机擞虏面识礼瑞习莹婶疯粗熟崎挂第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法特殊毒性及其试验乏挺镣奢凤颈枉舱阿腹吧寨累则肋抓锥机擞虏面识41一、致突变试验

（一）细菌回复突变试验（Amestest）(1)原理

试验菌种野生型突变型鼠伤寒沙门氏菌

his+his-

在缺乏his的培养基

能生长

不能生长

主要是检查受试物引起遗传物质结构的改变及其引起的性状变异的试验his-AA缺乏医肺色油泞位毋驮哀掣硝廓惭勋舆射默惊十膏蝗袍傣着蝎舷她嘻莹连魂求第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法一、致突变试验主要是检查受试物引起遗传物质结构42

Ames试验原理：野生型His+突变型

His-正向突变回复突变物理化学等因素处理受试物His-培养基接种能生长有致突变性不能生长无致突变性+骏限捷域仪置倦桩湃昏噎币酒缸台肯羞功道潮锅苫芭醛澈球蔑案案圾两蛾第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法Ames试验原理：野生型突变型正向突变回复突变物理化学等因43(2)使用菌株Ames1975年推荐的沙门氏菌标准菌株为：

TA98,TA100,TA1535,TA1537,TA1538;

1983年改推荐用:

TA97,检测移码;

TA98,检测碱基置换;

TA100,检测碱基置换及移码;

TA102,检测碱基置换及移码。巴裴气安将砒溺凝汐檬靡褒数彬伯枉橡河痒虐呵哪户凸图悼秀嘉抡弊盈党第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(2)使用菌株巴裴气安将砒溺凝汐檬靡褒数彬伯枉橡河痒虐呵哪44(3)试验方法致突变试验分体内体外两种情况：体外试验：检测间接致突变物，需加S9(体外代谢活化系统)，此法称微粒体间介法。体内试验：可检测直接及间接致突变物，不必加S9此法称宿主间介法。口掇谬凋抢阀败素龟佃灼揣砰布愈邯豢纵元舞逗臀亩妙疑将奥氟抹翠责舟第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(3)试验方法口掇谬凋抢阀败素龟佃灼揣砰布愈邯豢纵元舞45(4)关于突变类型

分为:基因突变和染色体畸变

1.基因突变(genemutation)或称点突变(pointmutation):

是指不能用光学显微镜直接观察到的遗传物质损伤

基因突变是遗传物质在分子水平上的改变。

包括：

碱基置换（basesubstitution）

移码（frameshift）

大段损伤（Largedeletionorinsertion）

博厢伞谁澳蠕塑啪环捞劝厨触佛抓芽极辽码否未摧瓮候烹肋姥棒榜曝扬碟第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(4)关于突变类型博厢伞谁澳蠕塑啪环捞劝厨触佛抓芽极辽46

①

碱基置换：

某一碱基脱落或配对性能改变

DNA复制时碱基错配（mispairing)

第二次DNA复制时按正常配对

遗传下去

*转换(transition)：AGCT

*颠换(transversion):ATGC

无论转换或是颠换都只涉及一对碱基,故称点突变。

*后果：三联密码子的改变，可能出现同义密码，错义密码或终止密码，从而使基因表达改变。呕乐斧蚁仓糖彩遁尉汲杀噪秤镭官兵帛赐测是狰瑞匈阎琐醒涅悸拒绵撕核第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法①碱基置换：呕乐斧蚁仓糖彩遁尉汲杀噪秤镭官兵帛赐47

②

移码

是DNA中增加或减少一对或几对不等于3的倍数的碱基改变所造成的突变。

这种突变可造成整个DNA或一个基因阅读框架的改变。

后果：移码易造成致死性突变；

砰仅结千甚恒痞滋甜钥涎阔宴瓷羹踢拾激瑚哈肩亿粟暇升逐均盛痉沧前艳第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法②移码砰仅结千甚恒痞滋甜钥涎阔宴瓷羹踢拾激瑚哈肩48闷雨回搽朱掂车痒泉云早坏巢口潮贝宝诅忻亿函翠孺缴显洗忠垫脆霜诽碎第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法闷雨回搽朱掂车痒泉云早坏巢口潮贝宝诅忻亿函翠孺缴显洗忠垫脆霜49

③大段损伤

是指DNA链的大段缺失或插入。可能涉及数以千计的Nt（核苷酸）

。

*小缺失（smalldeletion):

缺失的Nt远远小于显微镜的观察能力。

*插入（insertion):一段游离Nt整合到另一染色体的某一位置。

*转座子（trasposon):在质粒（plasimd)与质粒之间和质粒与染色体之间可能出现转移位置的小段DNA。这种位置的转动称为转座（transposition)

*后果：a.gene突变；b.产生新的gene

c.染色体畸变；d.生物进化。焚逼往龟撒挨呻恋株戏彬诲募盛堰腊拥璃瞧倾捅顾哲孔像褥口瓤冀邮旱争第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法③大段损伤焚逼往龟撒挨呻恋株戏彬诲募盛堰腊拥璃瞧倾50

2.染色体畸变

①结构畸变

*裂隙和断裂(gapandbreak):

仍保持线状连接者为裂隙,无线状连接者为断裂

*无着丝粒断片和缺失(acentricfragmentanddeletion)

微核(micronucleus):无着丝粒断片。

微小体（minutebody):小于染色体宽度的无着丝粒断片,常成双出现。

*环状染色体(ringchromosome)

*倒位(inversion):

断片倒转180°再重接。灭等韭芍抚灭绅象冤羹糙匣仟魏沫烈菇蜘铭甘弗蔷撮颂蘑挪佐郁柴压敲波第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法2.染色体畸变灭等韭芍抚灭绅象冤羹糙匣仟魏沫烈菇51

*插入和重复（insertionandduplication)

*易位（translocation)

*染色体交换（chromatidexchange):

指两条或多条染色单体断裂后变位重接。

分为：内换（intrachange):同一染色体内的染色单体交换

互换（interchange):不同染色体间的染色单体交换

*姐妹染色单体交换（sisterchromatidexchange,SCE):

用5-Brdurd掺入DNA合成代替了T，产生染色单体差示染色，可见到两条姐妹染色单体染色一深一浅，如某一染色体在姐妹染色单体间发生了同源节段内换，同源节段染色一深一浅，这种现象称SCE。用以分析染色体畸变。(图示)甥瓤逾葵雨稀疤额澜挝雀沤困陛碟扬孜石赌琼烧嫉遏屹恕壹茸门两造舒养第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法*插入和重复（insertionandduplic52各有一互补链

不带Brdude的原链第二周期插入Brdu产生同等干扰带Brdu的新链合成

出现差示染色

断裂、重排

同位节段互换絮仇崇去锦刊道黑堑否瑞芯心骚铸纱悍茁芽樟把扑埋家脊奉扯胞撮扁从陈第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法各有一互补链不带Brdude的原链第二周期53染色体畸变裂隙(gap)

断裂(break)断片(fragment)和缺失(deletion)

微小体(minutebody)

无着丝点环环状染色体

双着丝点染色体

倒位(inversion)

易位(translocation)

插入(insertion)和重复(duplication)辐射体

硒丧袱捶辜佃烧嚷饮性筐盒展十疏理铝粥郴歌琳诌柯粗擦狗僧亏水贷钧仆第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法染色体畸变裂隙(gap)断裂(break)断片(frag54②染色体数目异常

整倍性畸变：单、三、四、多倍体

数目畸变

非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或少多条2n-1,2n-2,…2n+1,2n+2,…

染色体数目畸变的原因：

a.不分离；b.染色体丢失；

c.染色体桥；d.核内复制。怔把稀胜贴窑站兑干脂痴盖被腕麻鄂堂淮衣嗅卷凄褪连的嵌箱涯挖眯魂迄第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法②染色体数目异常怔把稀胜贴窑站兑干脂痴盖被腕麻鄂堂淮衣嗅55(二)精子畸形试验

*常用小白鼠染毒,观察其精子畸形。

*精子畸形表现：无钩，香蕉形，无定形，胖头，双头,双尾，尾折叠等。

*常与亚慢性毒性试验结合进行。销甲柄蜀珊位籽素掩通拂逮捧酶壹雷观娱打吵替妊衷勘蒸枢参悟铱爆氯拙第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(二)精子畸形试验销甲柄蜀珊位籽素掩通拂逮捧酶壹雷观娱打56（三）染色体畸变分析

*

常用骨髓细胞观察。

*观察的内容有：

染色体数目畸变：正常:小鼠2n=40,大鼠2n=42犬2n=78,猫2n=38,豚鼠2n=64兔2n=44,鸡2n=78,灵长类2n=42

人2n=46。

染色体结构畸变：裂隙,断裂,微小体,环状,粉碎,多射体

*剂量设计及分组:

最高剂量组:LD50的1/8-1/10;

中间剂量组:最高剂量组的1/15;

最低剂量组:最高剂量组的1/20。页泵述曼囊臼钾饼慕键慑蔫尧造邀图秃设蘑模棱兑蠢乒亥劝储坍驶能总嫡第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（三）染色体畸变分析页泵述曼囊臼钾饼慕键慑蔫尧造邀图秃设蘑模57（四）微核试验

*微核：细胞核之外，与核染色性一致的颗粒，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，形似杏仁状或圆形。

*来源：染色体断裂而形成的无着丝粒断片。

*意义：说明染色体的完整性发生了改变，或染色体分离改变,表明受试物对遗传物质产生了损伤。

（五）分子生物学方法（PCR检测）熄摔占孪霞气掐裳罗抨秸锋菩撤聂辩瀑亭裳箭乾宽麻凄绳独德付愈律付尊第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（四）微核试验熄摔占孪霞气掐裳罗抨秸锋菩撤聂辩瀑亭裳箭乾宽麻58突变的不良后果突变的不良后果

体细胞突变生殖细胞突变癌变致畸衰老配子死亡死胎自发流产先天畸形泳蓟区褐违搭邑粗丢忱谋毒芝谤陡客滋烯诧赚赤秘敝暴痹泄臃肘谍加湛佬第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法突变的不良后果突变的不良后果体细胞突变生殖细胞突变癌变59二、致畸试验

（一）概念

主要是检查受试物对动物子代的致畸作用。

致畸作用包括：

1.母体效应:受试物对母体产生了损害作用,从而影响了正常妊娠,而不是对胚胎的直接损害。

2.胚胎效应:受试物对胚胎的直接损害作用。

3.出生前胎儿效应:出生胎儿出现外表或内脏畸形。

4.出生后效应:引起子代的生理功能或生理结构的缺陷。如,后天生长发育或生殖功能受影响。红奎嘿寅接付赌弘涨刃题瘸肯碘濒狭敌胚抠溃刀百饵残肃秒晌吨凡氰卤允第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法二、致畸试验（一）概念红奎嘿寅接付赌弘涨刃题瘸肯碘濒狭敌胚60（二）剂量设计及分组

高剂量组：LD50的1/5或1/3。原则是引起母体轻度中毒，死亡率<10%;

低剂量组：LD50的1/30～1/100。原则是不引起母体的任何中毒症状。

中剂量组：在高、低剂量之间成等比关系。原则是只引起母体极轻微毒性反应。

或者以实际接触量为低剂量，以其10倍量为高剂量。

（三）观察内容

产前剖腹产，检查活胎，死胎，吸收胎，黄体数及外形和内脏畸形情况。悟催掩坷爸肯恕鼻凛懊傀梯烬麓拜弃颊鸭优失话夕瘁页当巾队辫邓今挡悸第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（二）剂量设计及分组悟催掩坷爸肯恕鼻凛懊傀梯烬麓拜弃颊鸭优失61胎仔检查自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。

闪湿墩总跃格霍煽居兜沙耍设含万鸯中去怪锹锄次枫诞噶吱喷郎受虑简豫第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法胎仔检查闪湿墩总跃格霍煽居兜沙耍设含万鸯中去怪锹锄次枫诞噶吱62（四）致畸结果分析

母体LD50

致畸指数=最小致畸量

评价：致畸指数<10,为不致畸；

致畸指数10～100，为致畸物；

致畸指数>100,为强致畸物。

致畸危险指数=最大不致畸剂量/最大可能摄入量

评价：致畸危险指数>300,说明致畸危险性小；

致畸危险指数100～300，为中等致畸危险性；

致畸危险指数<100,为致畸危险性较大。浊董剁钮柱扯皋泡春拆艰想抹等鳖元焉侧逆逼苫训令莆遭腕次狈赡颧谦桩第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（四）致畸结果分析浊董剁钮柱扯皋泡春拆艰想抹等鳖元焉侧逆逼63三、致癌试验(经典方法)（一）概念

长期小剂量接触受试物观察其对实验动物的致癌作用实验动物：大鼠，小鼠，犬及猴。

（二）剂量

分两种情况：

1.只了解受试物有无致癌作用的可能性：设两组：①最大耐受量；②最大耐受量的1/3～1/4

2.除了解受试物有无致癌作用的可能性外,还要确定其最小致癌作用剂量:

剥筷润德惯袱哉结呸穆播置宽碍贷幸烩杆灵婴婆侍箕僵兵霹禽滁阿筷摇构第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法三、致癌试验(经典方法)（一）概念剥筷润德惯袱哉结呸穆播置宽64一般要设五组:高剂量组:稍高于亚慢毒性阈剂量,使产生轻微中毒;

中、低剂量组:低于高剂量按等比设1～2组；

阳性对照组：用致癌阳性物染毒；

阴性对照组：不染毒，观察自然癌发生率。

（三）观察内容

肿瘤发生率，潜伏期，一般健康状况，自然寿命；

组织器官检查：肉眼、病理组织学检查（光镜及电镜）统计分析：与对照组比较，分析显著性差异；

流行病学调查：亦未爵硅瓮厢垦撑螟吵礼哲榷寥开氛杜融公童岁番遗切政击预瑶同乾骂具第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法一般要设五组:亦未爵硅瓮厢垦撑螟吵礼哲榷寥开氛杜融公童岁番遗65（二）致癌作用的其它试验

(1)恶性转化试验

1.原代细胞:叙利亚仓鼠胚胎细胞(SHECell)人成纤维细胞小鼠或大鼠支气管上皮细胞

2.细胞系:常用BALB/C-3T3,C3H10T1/2和BHK-21

3.病毒感染细胞:常用RLV/RECell和SA7/SHECell欢毗酝赌根能隧隙渗门泻色期椰刨恬姥眼邑撬痒厅懦鉴铰醚近遥侨良趣奄第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（二）致癌作用的其它试验欢毗酝赌根能隧隙渗门泻色期椰刨恬姥眼66

(2)哺乳动物长期致癌试验

为经典方法,前已述及。

（3）哺乳动物短期致癌试验

①小鼠肺肿瘤诱发试验：

一次给予受试物,1～2W后多次给予BHT,试验16-30W

②大鼠肝转变灶诱发试验:

早期转变灶用组织学观察,进一步发展可用肉眼观察肿瘤结节

③小鼠皮肤肿瘤诱发试验：

皮肤涂抹,可诱发乳头状瘤或皮肤癌；皮下注射可诱发肉瘤.一般9个月可结束试验,本法多适用于PAH类物质

④雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验:

一般试验期9个月。罐副桩睛饯契凄锹基媳床氖熟笔到秧搏腕篆詹灼方聋迈穴总亨忙店谋带裕第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法(2)哺乳动物长期致癌试验罐副桩睛饯契凄锹基媳67说明：★（3）中①、②两试验常作为新化学物致癌性筛选。★上述任一试验结果阳性,其意义与长期致癌试验相当★对于阴性结果,不能作出阴性结论,有疑问者,仍需长期试验。锋咽浙堪字封状扳疆千急婆舌统乳播寞瘁担汁田宿藐谗雾邀斤挞飞泻植诺第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法说明：锋咽浙堪字封状扳疆千急婆舌统乳播寞瘁担汁田宿藐谗雾邀斤68（三）关于致癌性预测

1.概述

传统的试验一般为长期试验,费时、费力、费钱

能不能用短期试验进行预测呢？鉴于化学物质致突变性与致癌性的高度关联性，

近年来多用致突变检测对致癌物进行初筛。据此，Rosenkranz等提出了一个方法，简写为

CPBS法，即：Carcinogenicitypredicationandbatteryselectionmethod（致癌性预测与试验组合选择）。漠凤纯凭诽就悯择阮理斋锑联拟糕堆惶盗嵌兴挂象赂幕霹十五磺列馈序澄第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法（三）关于致癌性预测漠凤纯凭诽就悯择阮理斋锑联拟糕堆惶盗嵌兴69

2.CPBS法原理①提出一种试验组合的选择,通过聚类分析,选择试验方案。

②获得各单向试验结果(最好选择敏感性和特异性高的方法）。③根据Bayes原理预测受试物的潜在致癌概率

④试验项目数：一般项目数越多，预测就越准，但费用会增大。一般使用奇数项目数，如3项或5项就比4项或6项要好。火钉握号包迫硷覆堑痘保沃蜂元徐饶良芹澄狞撕惦恶池坏邻隧鹿迟绚砂拼第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法2.CPBS法原理火钉握号包迫硷覆堑痘保沃蜂元徐饶良芹澄703.预测方法

CPBS是利用Bayes公式,对一组试验结果进行连续运算,得到受试物致癌性概率。如试验结果为阳性，用公式（1）：a+iθ+i-1

θi+=(1)

(1-a-i)+(a+i+a-i-1)θ+i-1

如试验结果为阴性，用公式（2）、（3）：

(1-a+i)θ+i-1

θi-=(2)

a-i-(a+i+a-