毕业论文-市售鲜奶的黄曲霉毒素M1残留调查

南京晓庄学院2015届毕业论文1前言黄曲霉素是由黄曲霉或其它寄生性曲霉菌的代谢所产生的物质。黄曲霉主要存在于土壤中或动植物中，黄曲霉素主要存在于被黄曲霉等菌物所污染物质中。黄曲霉素常污染含油量较高的谷物中、禽蛋、玉米、肉、奶制品，其次是含淀粉量较高的果实中，但污染大豆等作物的程度比较少。黄曲霉素是所有霉菌毒素中毒性最大、这一类毒素对人类健康造成极大的危害。粮食和饲料被黄曲毒素污染的可能性很高，给饲料企业和养殖户造成大量经济损失，被黄曲霉素污染的食物误食后，会严重影响到人体的健康。该论文主要是介绍有关市售生牛乳的黄曲霉残留调查。1.1研究背景20世纪60年代，在英国一养殖场发生十万只火鸡突发性死亡，调查最终结果显示，巴西进口的花生粕被由于饲料在生产运输过程中被黄曲霉素污染所引起的。经研究发现，黄曲霉毒素是由特曲霉产生，但是量相对较少。产生的黄曲霉素的类型主要有B1,B2,G1,G2和另外两种主要存在于牛奶中，代谢产物M1,M2等。经牛奶中分离出来的M1和M2，在分子结构上与B1,B2,G1,G2非常接近。黄曲霉毒素B1自从这件事后，研究人员对黄曲霉素对食品安全特别关注，在对所有毒素的研究中，黄曲霉是研究最透彻的品种之一。已经被发现的黄曲素已有十几种之多。黄曲霉素M1主要出现在各种奶制品中，黄曲霉素M1和黄曲霉素M2并不是有黄曲霉菌分泌的，毒性也相对较弱。在黄曲霉素中毒性最强的应该是黄曲霉素B1，B在颜色中表示蓝色，因为黄曲霉素B1在紫外光下会呈现出蓝色荧光。除B2以外，还含有G1和G2两个类型，因为在紫外光的照射下会呈现出黄绿色荧光。农产品中出现的黄曲霉素通常用B1、B2和G1、G2代表。奶牛食用含有B1和B2的饲料后，其中有一小部分会分解为M1和M2进入牛奶中，这事牛奶中黄曲霉素的来源之一。国际上，只设定相应的限量标准，如果超过这个标准，人食用含有黄曲霉素的食物后会对身体造成极大的危害。在英国十万只火鸡死亡的死亡，就是由于火鸡饲料被黄曲霉污染。研究人员发现一些霉变的花生，花生中所含有的黄曲霉素B1严重超标。食品中，黄曲霉素的单位用ppb表示，1ppb表示1吨粮食或饲料中约有1mg的黄曲霉素。我国现在制定的指标中花生中黄曲霉毒素B1必须少于20ppb。研究人员采用有机溶剂萃取溶液的得手段到含有黄曲霉素的油，在油中检测出B1含量为120ppb。霉变的花生饼中的含量则高达11000ppb，如将霉变花生饼喂食动物，动物会出现中毒情况。工业化生产加工的流程，提取出来的粗油必须要精炼。精练采取分级的方法，第一次提取，黄曲霉素B1的含量能降到了10ppb，已经到达食用标准。第二提取，含量就低于1ppb。在粮食发生霉变之前，黄曲霉毒素的含量也达不到这样的标准。经过精炼的食用油食用更加安全。多数人都知道粮食受潮会发生霉变，会产生大量黄曲霉素。其实，在农作物生长期中黄曲霉素就可以形成。例如玉米，土壤中的黄曲霉菌会在玉米棒采收前就已经受到侵染。在适宜的条件下，作物采收前黄曲霉素的含量就已经超标了。另外，种植密度太大、杂草丛生的环境或是氮肥施加不够、病虫害的侵染等因素，都会引起黄曲霉素的超标。黄曲霉毒素B11.2基本了解黄曲霉毒素是一种剧毒物质，甚至在93年被世界卫生组织划为1类致癌物质。它的主要作用是可以破坏生物的肝脏功能，甚至可以致癌致死。在天然污染的食品中，黄曲霉毒素B1毒性和致癌性也是非常强的。1.3化学结构黄曲霉毒素M1黄曲霉毒素是化学结构相似的一类化合物，M1是黄曲霉毒素B1在生物体内代谢产物衍生物。它的主要有B1,B2,G1,G2,M1,M2等分子型式。通常在牛奶中的主要是M1和M2。毒性并且致癌性最强的物质是B1。黄曲霉毒素M11.4物质特点黄曲霉毒素B1,B2在紫外灯光照射下发出蓝色荧光，黄曲霉毒素G1,G2会显现出绿色荧光。相对分子量为312-346之间。黄曲霉素难溶于水，易溶于多数有机溶剂，但不能溶于石油醚和乙醚中。在中性溶液中一般比较稳定，在强酸溶液中有部分分解，纯黄曲霉毒素为无色结晶，268℃以上黄曲霉毒素B1会分解。紫外线对对其结构有一定破坏性。

1.5临床特征黄曲霉毒素B1是食品安全中毒性最强，一般有表现这为三种临床特征；急性中毒、慢性中毒和致癌性2、材料与方法：2.1器材与试剂烧杯，100μL移液枪，培养箱，酶标仪，量筒，1000μL移液枪，检测采用黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒2.2材料市售含有生牛乳产品。2.3试剂的配置2.4.1酶标抗原工作液：1瓶酶标抗原，加入1.5ml酶标抗原稀释液，溶解，用酶标抗原工作液，每瓶酶标抗原够24孔反应板，2~8℃。2.4.2洗涤液：取浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍。2.4样品处理生牛乳，牛奶冰箱冷藏10℃以下，离心机3500转/min10分钟，弃上清，取下层牛奶，脱脂奶直接测定。样品进行ELISA测定。2.5操作步骤：2.5.1平衡试剂：从试剂盒里取出试剂，把试剂放常温下15-20分钟，与室温平衡。2.5.2配制酶标抗原：向酶标抗原里加入1.5mL酶标抗原稀释缓冲液，放振荡器上震荡1分钟左右，让其充分混匀，这就是所得的酶标抗原工作液。2.5.3洗涤液配制：向烧杯中吸取5mL浓缩洗涤液，然后倒入95mL蒸馏水，摇匀。2.5.4编号酶标孔：取反应条。标记1—6号孔作为标准对照孔，剩余孔当作样品孔。2.5.5洗涤操作：向每孔内加入250μL洗涤液，静置1分钟。甩干，并在吸水纸拍干。2.5.6加样品：分别向1-6号孔内加入50μL标准溶液，剩余孔加入需要测样液。2.5.7加酶标抗原：向每孔内滴入50μL酶标抗原工作液。2.5.8试剂混匀：轻轻震荡酶标板框架，让试剂混匀。2.5.9恒温孵育：放入37℃培养箱，30分钟2.5.10洗涤操作：把反应板拿出来，甩干，用力拍干。向每孔加入250μL洗涤液，静置1分钟。用力甩干，并在吸水纸上拍干，反复清洗4次。2.5.11显色操作：拍干后，向每个反应孔内加入50μL底物液以及50μL显色液。2.5.12混匀试剂：轻摇反应孔使试剂充分混匀。2.5.13恒温孵育：再次放入37℃培养箱，等待15分钟2.5.14反应终止：向每孔加入50ul终止液。轻摇酶标板，让试剂完全混匀。2.5.15仪器读数：加入450nm酶标仪，读取各孔的吸光值数值。第二波长为630nm参照。2.5.16数据处理：实验数据处理。关闭仪器。整理3结果3.1AFM1标准曲线将系列AFM1标准溶液测得的吸光值OD值，绘制成标准曲线（如图1）。横坐标为标准溶液浓度的常用对数值（lgC），纵坐标为各标准孔OD值与Oppb标准OD值的比值[B（标准液）/B(Oppb)]。黄曲霉毒素M1标准曲线示意图测样品孔OD值与OD（Oppb）的比值[B（样品）/B(0ppb)]，可得到相应待测样液浓度的常用对数值lgC，对其求反对数，可求得待测样液的AFM1浓度C。按公式计算出样品中AFM1的含量：AFM1含量式中：C:样液中所含有的AFM1含量（ppb或μg/kg)V：样品提取液体积（mL）M：样品质量（g）D：样品提取液的再稀释倍数3.2AFM1检测结果表1牛奶样本中黄曲霉毒素M1含量检测结果样本序号样本中AFM1含量(μg/kg)样本序号样本中AFM1含量(μg/kg)a1-10.05b4-10.05a2-10.08b5-10.04a3-10.10b6-10.08a4-10.14b7-10.05a5-10.10b8-10.05a6-10.10c1-10.06a7-10.14c2-10.13b1-10.06c3-10.13b2-10.05c4-10.06b3-10.07由表1可以看出，在检测的19份牛奶样本中，检出AFM1的牛奶样本的AFM1含量介于0.05～0.14μg/kg之间，均低于国家标准GB2761-2011所规定的0.5μg/kg的最高的残留、农业行业标准NY/T657-2007和NY5140-2005中规定的0.2μg/kg的最高限量。4讨论4.1食品中黄曲霉毒素的国内外限量标准人们对食品的问题的关注，黄曲霉的污染问题也越来越受到关注，为了保护本国的利益，都制定了相应的黄曲霉毒素的最高的限量标注。4.2国际法中对黄曲霉毒素限量标准国际法中规定，对于食品中黄曲霉毒素的最大残留限量标准为15μg/kg。4.3加强国际标准跟踪，提高标准制修订速度最近几年，各个国家对毒素标准的修改越来越多，严格要求它的限量标准，进出口检验越来越多。4.4提升毒素检验能力，增强进产品质量的检测我国食品出口经常会碰到到黄曲霉超标的问题，把花生为原料出口作为例子，09年本国出口欧盟花生制品有几十批被检测出黄曲霉毒素超标，占出口总数的23.5%。因此，本国不仅要完善自身标准，还要完善检验检测的手段，把好出口检验关，提高出口产品质量。4.5完善质量管理体系选取优质花生减少黄曲霉的发生。因此，我国企业建立了完善质量保障体系，确保产品的质量安全。由实验结果我们可以很明显地看出，市售鲜奶的黄曲霉毒素M1残留调查可以发现基本上市售牛奶的黄曲霉毒素M1残留都是在标准之内的。但从表中可以看出，牛奶制品a4-1和a7-1离农业行业标准NY/T657-2007和NY5140-2005中规定的0.2μg/kg的最高限量只差0.06μg/kg，达到了0.14μg/kg，最低的a1-1也有0.05μg/kg；而在酸牛奶制品中则相对而言黄曲霉毒素M1残留较少，最低为b5-1数值为0.04μg/kg，最高为b6-1数值为0.08μg/kg；饮料制品中黄曲霉毒素M1残留相对于酸牛奶制品业相对较高，并且毒素M1残留较高的样品占饮料样品的比重也较大，最高的是c2-1和c3-1都达到了0.13μg/kg，最低的也有0.06μg/kg。从结果中我们不难看出市售的奶制品中，酸奶制品的黄曲霉毒素M1残留是最少的，而牛奶和饮料的黄曲霉毒素M1残留相对而言较高。因此，我们认为在企业生产牛奶和饮料制品时应当更加注重卫生、原料等等条件的把控。在制品完成时，多抽组进行质量检测和残留检测，确保出厂的产品质量与残留达标，达到安全生产。参考文献[1]丁俭.牛奶中黄曲霉毒素M1和食用植物油中赭曲霉毒素A检测技术研究[D].中国农业科学院.2013.[2]王蕾.牛奶中黄曲霉毒素M1检测方法的建立及饲料中黄曲霉毒素对牛奶品质的影响[D].河南农业大学.2008.[3]杜树新,蒋丹红.基于STM的三维荧光导数光谱法检测食品中黄曲霉素[J].光电子.激光.2014.[4]周贻兵,林野,李磊,王娅芳,刘利亚.高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M1的含量[J].食品研究与开发.2014.[5]石欲容,甄蕊.日立高效液相色谱仪柱后光照衍生法同时测定牛奶中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1[A].中国仪器仪表学会分析仪器分会、中国仪器仪表学会农业仪器应用技术分会.2012中国食品与农产品质量安全检测技术应用国际论坛暨展览会论文集[C].中国仪器仪表学会分析仪器分会、中国仪器仪表学会农业仪器应用技术分会.2012.[6]田维荣,代兴红,胡萍.牛奶中黄曲霉毒素的危害及质量控制[J].畜牧与饲料科学.2013.[7]丁俭,李培武,李光明,王秀嫔,马飞.在线固相萃取富集-高效液相色谱法快速测定牛奶中黄曲霉毒M1[J].食品科学.2013.[8]王韦岗.柱后光化学衍生高效液相色谱法同时测定牛奶中黄曲霉毒素[J].化学分析计量.2013.[9]钱洋.乳酸菌对食品中常见霉菌的抑制和黄曲霉素的去除[D].山东大学.2012.[10]齐琪