Hela细胞凋亡诱导与检测

细胞生物学实验10/10Hela细胞凋亡诱导与检测实验目的：学习掌握细胞凋亡的原理以及诱导凋亡的方法。了解DAPI染色的原理、方法并用它检验细胞凋亡。实验器材显微镜、移液器、离心机、显微镜、载玻片、盖玻片、擦镜纸、显微摄影技术仪器、锡纸。实验试剂PBS溶液以成品干粉加超纯水配制；过滤后121ºC灭菌20min，4ºC保存H202溶液消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液DAPI染液实验步骤：细胞凋亡诱导将对数增长期的细胞用0.25%胰酶消化，调整细胞数为4×105/L，胞悬浮于100μLDMEM培养基。加H2O2处理，至终浓度为0.8mmol/L。（H2O2母液浓度8.8mol/L）24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。细胞凋亡检测收集细胞(200uL胰酶37℃消化后，再加入1mL培养基)至1.5mLEP管，1000rpm离心5min。吸出上清，于沉淀中加入100uL甲醇溶液，室温固定10min。1000rpm离心5min。弃上清，加100uLPBS洗涤沉淀细胞。1000rpm离心5min。弃上清，加50uLDAPI，于37℃染色10min。1000rpm，离心5min。弃上清，加100uLPBS洗涤。1000rpm，离心5min。弃上清，加15uLPBS重悬细胞。取15uL悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察。整理：实验结束后把桌面收拾干净，东西统一放回后面的台子上。用完显微镜要复原显微镜，如果用了油镜要擦拭镜头。实验结果：分裂期细胞细胞的凋亡检测：分裂期细胞图1：细胞凋亡检测（图中标出的为处于分裂期的细胞）分裂中期细胞图2：细胞凋亡检测（图中标出的为处于分裂中期的细胞）分裂中期细胞实验初期，我在视野中观察到了很多如上图中标出的细胞，并误以为是凋亡细胞。但是观察发现，该类细胞并无特别致密且分散的蓝色荧光，高亮区域主要集中在中间，且过于密集。图2则更加明显，蓝色区域呈现出规则的纺锤形，在细胞中间还能够观察到排列整齐的染色体，说明该细胞正处于有丝分裂中期。经过老师确认后，这些细胞都是处于分裂期的细胞。通过对比分裂期的细胞，将其设为对照，处于凋亡stageIIb期的细胞处于凋亡stageIIb期的细胞图3：细胞凋亡检测（处于凋亡stageIIb期的细胞）处于凋亡stageIIb期的细胞图4：细胞凋亡检测（处于凋亡stageIIb处于凋亡stageIIb期的细胞处于凋亡stageIIa期的细胞处于凋亡stageIIa期的细胞图5：细胞凋亡检测（处于凋亡stageIIa期的细胞）如图3-5所示，图中标出的细胞处于凋亡的不同时期，说明之前细胞传代培养以及凋亡诱导的成功。本次观察到的凋亡细胞主要为IIa和IIb两个阶段。处于这两个阶段的细胞形态比较特殊，染色情况比较容易分辨。这两个阶段同有丝分裂的细胞有着较大的区别。首先，可以见到较为分散且数量较少的染色亮斑；其次染色较深的区域并没有集中在中央，呈弥散状，而是散布在细胞的各个位置；stageIIa的细胞中能够观察到明显的核形变化。受到染色时间、染液分布等问题的影响，我很难确定处于凋亡I期的细胞。由于在进行观察拍照前，细胞经过了多次离心，因此凋亡小体基本上被去除，很难观察到。分析与讨论：细胞凋亡的检测方法：1）形态学观察方法1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。2）DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。3）酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。4）流式细胞仪分析细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。细胞坏死、自噬与细胞凋亡：我们经常接触到细胞坏死、自噬与凋亡这三个名词，它们之间有着什么样的区别呢？三者都是细胞发生形态变化的生理过程，但是其特征以及诱因不同，生物学的意义也不同。其中细胞坏死和细胞凋亡直接导致细胞的死亡，而自噬则是通过消化分解细胞器以维持细胞成分的稳定，不直接导致细胞死亡。细胞坏死是因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。细胞坏死的特征为线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症。自噬主要的生理功能是将胞质中的大分子物质（如蛋白质、RNA、过量储存的糖原等）和一些细胞内源性底物（包括由于生理或病理原因引起的衰老、破损的细胞器）在单位膜包裹的囊泡中大量降解，实现再循环，以维持细胞自身的稳定。这个过程对于细胞成分更新、保持旺盛的生理状态是至关重要的。在此过程中，自噬体的形成是关键，其直径一般为300~900nm，平均500nm，囊泡内常见的包含物有胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。图6：细胞自噬示意图细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。图7：细胞凋亡示意图表1：细胞凋亡和细胞坏死的区别类型细胞凋亡细胞自噬细胞坏死起因生理或病理性生理或病理病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞区域细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小体保持完整破损染色质凝聚在核膜下呈半月状无变化呈絮状细胞器无明显变化被吞噬体包裹肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小基本不变肿胀变大基因组DNA有控降解，电泳图谱呈梯状无降解随机降解，电泳图谱涂抹状调控内部因素内外因素都可影响外部因素炎症反应无无有实验总结思考：这次实验，我们在细胞传代培养的基础上进行了细胞凋亡的诱导和检测试验。在课上，我了解细胞传代培养和细胞凋亡诱导的原理以及方法和具体操作时的注意事项，成功地观察到了处于凋亡期的细胞。最重要的是