杂交瘤技术的实验原理及其操作演示

杂交瘤技术的实验原理及其操作演示演示实验（一）.接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞一、杂交瘤技术产生的3个技术关键1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞(Blymphocytes)：.骨髓瘤细胞(myelomacells):恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。.2.细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命Köhler和Milstein,19751984年Nobel医学奖.3.杂交瘤细胞的筛选：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/脾细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活.HAT培养基筛选H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途径(旁路途径).二、杂交瘤技术的操作流程1.动物免疫：目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.特定目标抗原动物免疫脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体.常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法常用免疫方法：“稳妥；优势克隆”皮下注射腹腔注射静脉注射免疫途径：“省时；省抗原”“省时”“操作繁琐”.常规免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂第3次免疫：抗原+不加佐剂第4次免疫：抗原+不加佐剂(皮下注射或静脉注射)(皮下注射)(皮下注射)(静脉注射).二、细胞融合及HAT筛选病毒介导的细胞融合PEG介导细胞融合电激融合1、细胞融合方法：.细胞悬液的制备与融合(1)脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备

(2)骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备(3)细胞融合：50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1min.2、HAT培养基的筛选融合后细胞混合液HAT培养基2weekslaterHT培养基正常培养基1weeklater.三、抗体的检测要求：

简便、快速、敏感;在短时间内能检测大量样品常用方法：酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)双相扩散法.酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：.四、克隆化常用克隆化方法：有限稀释法软琼脂平板法显微操作法80个细胞/96孔饲养细胞(feedercells)ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。.由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇——单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)单克隆抗体优点：高度纯一高度专一应用：疾病的论断和治疗(生物导弹)生物大分子的鉴定、定位和分离纯化细胞器的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离.五、大规模培养——批量生产单克隆抗体常用的大规模培养方法：动物接种法转瓶培养法细胞培养罐法.培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体动物免疫细胞融合混合细胞的HAT筛选)分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天