沙雷氏Z4菌株Tn5转座突变株的群体淬灭活性筛选体系的建立及优化

沙雷氏Z4菌株Tn5转座突变株的群体

淬灭活性筛选体系的建立及优化摘要：利用Tn5转座子插入突变技术构建沙雷氏Z4菌株突变体库，研究不同因素对转座突变的影响，在此基础上初步探究了突变株的群体淬灭能力.结果表明，采用双亲本接合法，选择对数生长期的沙雷氏Z4菌株与大肠杆菌S17-1(pRL1063a)菌液1：1混合，3ITC培养3h后，涂布于含50院/mL卡那霉素和25院/mL四环素的LB固体培养基上，长出的突变株数量最多；随机选择突变株进行群体淬灭能力测试，结果筛选到了3株群体淬灭能力明显与沙雷氏Z4野生型有差异的突变株.本研究采用的Tn5转座突变技术为研究群体淬灭菌的基因功能以及生理代谢提供了有效的分子遗传工具，也为研究群体淬灭提供了新的途径.关键词：Tn5转座子插入突变技术；群体淬灭；沙雷氏菌群体感应(QuorumSensing,QS)现象普遍存在于微生物群落中，指微生物在生长过程中根据群体密度变化而调控基因表达的一种生理行为［1-3］.研究发现［4］,微生物QS是通过自诱导因子(Autoinducer,AI)的浓度调控基因表达.目前发现的自诱导因子包含N-酰基高丝氨酸内脂(AcylHomoserineLactone,AHL)［5］、自诱导因子2(Autoinducer-2,AI-2)［6］、扩散信号因子(DiffusibleSignalingFactor,DSF)［7］等.其中，AHL信号分子主要由高丝氨酸内酯环和酰基侧链组成，侧链依据不同长度可分为C4—C18等多种类型.细菌通过群体感应系统调控多种生理行为，如生物膜的形成与成熟［8］、生物发光现象［9］、毒力因子产生［10］等.群体感应给环境、农业、医药等行业领域发展带来机遇的同时也带来困难和挑战，因此干扰细菌的群体感应系统是目前研究的热点之一.群体淬灭(QuorumQuenching,QQ)是指在不影响细菌生长的情况下，阻断或干扰群体感应，抑制或者破坏细菌QS系统，从而阻断细菌信息交流的一种有力手段［11］,常被应用于疾病控制和减缓生物膜污染等［12-13］方面.尽管已在Rhodococcussp.［13］、Bacillussp.［14-15］、Serratiasp.［16］等多种属细菌中发现QQ现象，但对其作用机理仍知之甚少.我们课题组前期已筛选出一株具有高效群体淬灭能力的沙雷氏Z4菌(Serratiasp.Z4),本研究采用Tn5转座子插入突变技术，构建沙雷氏Z4菌突变体库.通过研究不同供受体混合比例、不同培养时间、不同抗生素选择压力以及不同菌株生长状态对突变的影响，进一步优化Tn5转座突变条件.在此基础上，研究优化条件后获得的突变株对两种AHL信号分子——N-己酰基-L-高丝氨酸内酯（C6-HSL）和N-辛酰基-L-高丝氨酸内酯（C8-HSL）的降解能力，筛选具有QQ能力差异的沙雷氏Z4突变株，为未来Z4菌更好地应用提供分子技术及基础理论.1实验材料1.1菌株与质粒本实验使用的菌株及质粒见表1.其中，沙雷氏Z4菌株是本实验室从温州市经济开发区滨海工业区第一污水处理厂采集的污泥中分离获得;大肠杆菌S17-1作为双亲本接合实验的供体菌;质粒pRL1063a是经过改造的具有Tn5转座子的自杀载体；紫色色杆菌CV026和根癌农杆菌KYC55购自于北京百欧博伟生物技术有限公司，作为群体感应生物传感器.表1菌株及质粒名称 描述 来源菌株沙雷氏Z4菌株大肠杆菌S17-1紫色色杆菌CV026根癌农杆菌KYC55（pJZ372\pJZ384\pJZ410）抗四环素；QQ功能作为供体菌抗卡那霉素；QS生物传感器抗庆大霉素、壮观霉素、四环素；QS生物传感器本实验室本实验室北京百欧博伟北京百欧博伟质粒pRL1063a携带Tn5转座子，抗卡那霉素本实验室1.2培养基LB培养基（g/L）.胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、氯化钠10.调pH7.4-7.5之间，121。。高压灭菌30min.固体培养基加入1.5%的琼脂粉.AT培养基（g/L）[17].配置20XATsalt（g/L）：硫酸铵40、硫酸镁1.56、七水硫酸铁0.1、一水硫酸锰0.044；配置20XATbuffe（g/L）：磷酸二氢钾214，调pH7.3；配置50%葡萄糖；各组分单独灭菌或过滤除菌.AT培养基：20XATsalt50mL、20XATbuffe50mL、50%葡萄糖10mL、无菌水896mL、1.5%琼脂粉.用于检测群体淬灭能力时，需加入相应的抗生素以及5-漠-4-氯-3-吲噪-K-D-半乳糖苷（X-gal）.1.3实验试剂试剂母液的配置见表2.表2试剂贮液的配置试剂名称 贮存液浓度及配置方法卡那霉素（Km）100mg/mL，水溶液，4。。保存壮观霉素（Spe）100mg/mL，水溶液，4。。保存庆大霉素（Gm）100mg/mL，水溶液，4。。保存四环素（Tc）50mg/mL，70%乙醇溶液，-20。。避光保存N-己酰基-L-高丝氨酸内酯（C6-HSL）1mg/mL，甲醇溶液，-20。。保存N-辛酰基-L-高丝氨酸内酯（C8-HSL）1mg/mL，甲醇溶液，-20。。保存5-漠-4-氯-3-吲哚-QD-半乳糖苷（X-gal）100mg/mL，二甲亚砜溶液，-20。。避光保存2实验方法2.1菌株活化将所需的菌株分别在相应的培养基以及温度下活化，见表3.表3菌株培养条件菌株名称培养基抗生素及其浓度温度/C沙雷氏Z4菌株LB25gg/mLTc30大肠杆菌S17-1(pRL1063a)LB100gg/mLKm37紫色色杆菌CV026LB50gg/mLKm30根癌农杆菌KYC55LB/AT50gg/mLGm;50gg/mLSpe;2gg/mLTc302.2双亲本接合借鉴张茜等［18］所采用的双亲本接合法，挑取供体菌大肠杆菌S17-1（pRL1063a）和受体菌沙雷氏Z4菌单菌落，分别接于含有100gg/mLKm和25此/mLTc的LB液体培养基中，振荡培养16h；至对数生长期（OD600为1.500左右）分别收集供体菌及受体菌以1：1比例混合，12000rpm离心2min,弃上清；加入1mLLB液体培养基重悬浮后，30。。振荡培养3h，使两者充分接合;取50gL菌液涂布于含有50gg/mLKm和25gg/mLTc的LB固体培养基，30°C培养24h.2.3Tn5转座突变株的PCR验证挑取双抗筛选固体培养基上的单菌落于新的LB液体培养基上（含相应抗生素），根据分子克隆实验指南［19］，提取突变株基因组DNA；根据pRL1063a中的luxAB序列设计合成特异性扩增弓I物（luxABP1:5'-TTTGTTCGGCTTGGTATCGC-3'和luxABP2:5'-ATTGCTTAGGTCCTTCTCA-3'）,以突变株基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）验证.PCR反应体系及反应程序见表4.表4PCR反应体系及反应程序组分体积/gL组分体积/gLTaqPCRMasterMix10模板DNA1luxABP11ddH2O7luxABP21反应程序：94C4min；94C30sec；55C90sec；72C1min；30个循环；72C10min；4C保存.2.4转座突变条件优化采用单因素实验，在其他条件不变的情况下，分别改变Tn5转座子插入突变中的供体菌和受体菌的混合比例（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5）、供受体菌混合培养时间（1h、3h、5h）、抗生素选择压力（Km含量分别为100gg/mL、75gg/mL、50gg/mL和25gg/mL、Tc=25gg/mL）以及沙雷氏Z4菌的生长状态（OD600分别为0.200、1.500和4.000），统计长出的突变株数量，获得最佳的转座突变条件.2.5群体淬灭差异突变株筛选在优化的突变条件下进行沙雷氏Z4菌株Tn5转座突变，建立沙雷氏Z4菌株突变体库.具体步骤如下：将2.3中PCR验证为阳性的突变株接于同时含有50gg/mLKm和25gg/mLTc的LB液体培养基中，30C振荡培养12-16h；用无菌LB液体培养基稀释Z4突变株OD600至2.600-2.700之间；取10mL菌液，加入信号分子C6-HSL或C8-HSL至终浓度为10gmol/L,30°C振荡培养4h；取培养液过滤除菌，作为待测液，-20C保存备用.紫色色杆菌CV026报告菌为紫色色杆菌ATCC31532的mini-Tn5的突变体［20］,自身不能合成AHLs信号分子，当出现外源AHLs信号分子时，会产生紫色色素［20］.本实验借鉴李晴等［21］群体淬灭活性检测方法，将CV026接种于含50gg/mLKm的LB液体中，30C振荡培养至OD600为1.000左右;加热融化100mL的LB固体培养基，静置冷却至40C-50C，加入终浓度为50gg/mLKm和10mLOD600为1.000左右的CV026菌液，倒固体培养基冷却凝固，打孔，加入待测液，30C正置培养24h，观察紫色圈大小，以C6-HSL显色圈作为阳性对照.若具有QQ能力，则待测液中的C6-HSL会被降解而使得显色圈小于阳性对照；若无QQ能力，则显色圈会同阳性对照的直径大小一致.根癌农杆菌KYC55报告菌在含有外源AHLs信号分子和X-gal的培养基中培养时，会产生大量的"-半乳糖苷酶与X-gal反应呈现蓝色.本实验借鉴盛吉洋［22］的检测方法，将KYC55接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，30C振荡培养24h；加热融化AT固体培养基，静置冷却至40C-50C，加入相应抗生素、终浓度为100gg/mL的X-gal和10mLKYC55菌液，打孔，加入待测液，30C正置培养24h，观察蓝色圈大小，以C8-HSL显色圈作为阳性对照.若具有QQ能力，则待测液中的C8-HSL会被降解而使得显色圈小于阳性对照；若无QQ能力，则显色圈会同阳性对照的直径大小一致.用信号分子C6-HSL和C8-HSL作为阳性对照，Z4野生型菌株降解信号分子作为阳性对照，水作为阴性对照.若观察到突变株降解信号分子的显色圈比Z4野生型显色圈的直径大，则Tn5插入了编码群体淬灭酶基因中，从而获得群体淬灭缺失突变菌株.3结果与分析3.1沙雷氏Z4菌株Tn5转座突变株的PCR鉴定对沙雷氏Z4菌株进行Tn5转座突变，通过Km和Tc双抗筛选，构建了库容量较多的沙雷氏Z4菌株突变体库.以随机挑选5株Z4突变株基因组DNA、Z4野生型基因组DNA以及pRL1063a质粒DNA为模板进行PCR验证（图1）,结果都得到了大小约为1.6kb的条带，与1:DNA分子量标记2-3:pRL1063a质粒DNAPCR条带（阳性对照）4-5:Z4野生型基因组DNA

PCR条带（阴性对照）6-15:5种突变子基因组DNAPCR条带16:DNA分子量标记1 2 3 45678910111213141516岂 W图1沙雷氏Z4突变株中Tn5插入验证的PCR图谱

预期结果相符.说明Tn5转座子已成功插入了沙雷氏Z4菌株中，且获得了同时具有Km以及Tc抗性的沙雷氏Z4菌株Tn5转座突变体.3.2供受体菌混合比例对Tn转座突变效率的影响研究表明［23］供体菌和受体菌之间的混合比例对筛选突变株非常关键，只有当受体菌数量适量高于供体菌时才能获得较高的突变株数量.收集菌浓一致的供体菌一一大肠杆菌S17-l(pRL1063a)以及受体菌——沙雷氏Z4菌菌液，将两者分别按照1：1、1：2、1：3、1：4、1：5的比例接种于含有50此/mLKm和25gg/mLTc的LB固体培养基上，对长出的突变株进行统计(图2、图3).图2不同比例混合的沙雷氏Z4菌与大肠杆菌S17-1(pRL1063a)对Tn5转座突变效率的影响图3不同比例混合的沙雷氏Z4菌(受体菌)与大肠杆菌S17-1(pRL1063a)(供体菌)对Tn5转座突变效率的影响结果表明，供受体比例在1：1至1：3之间，Tn5转座突变能获得较多的突变株，而随着沙雷氏Z4菌数量逐渐增多，获得的突变株数量逐渐减少.可能是因为在30。。下沙雷氏菌生长速度快于大肠杆菌，当受体沙雷氏Z4菌数量大大增加时，会抑制大肠杆菌S17-1(pRL1063a)的生长，导致Tn5转座子只能插入少部分的沙雷氏Z4菌中，使得突变株数量减少.因此，选择供受

体菌混合比例为1:1.3.3混合培养时间对Tn转座突变效率的影响以1：1比例混合的沙雷氏Z4菌与大肠杆菌S17-l(pRL1063a),分别于30。。混合震荡培养1h、3h和5h，观察突变株生长情况(图4).结果表明，不同混合培养时间后，都可以长出很多的沙雷氏Z4突变菌株，且随着混合培养时间延长，突变株的数量增多.说明，在双亲接合法中，供受体菌接合培养时间越长，接触越充分，Tn5转座子插入突变的效率就越高.但随着混合培养时间延长，混合菌不断生长，突变株单菌落越来越密集，不利于后续单菌落挑取进行传代培养.因此，选择混合培养时间3h进行后续实验.3.4抗生素选择压力对Tn转座突变效率的影响图4混合培养时间对Tn5转座突变效率的影响考虑到抗生素选择压力对沙雷氏Z4菌转座突变的影响，本实验分别检测了大肠杆菌S17-1(pRL1063a)以及沙雷氏Z4菌株对Km和Tc的敏感性(图5).结果表明，在分别含有100gg/mL、75gg/mL、50gg/mL和25gg/mLKmLB固体培养基上，沙雷氏Z4菌的生长都受到抑制，而大肠杆菌S17-l(pRL1063a)在含有不同浓度的Km固体培养基上都正常生长;在分别含有100gg/mL、75gg/mL、50gg/mL和25gg/mLTc的LB固体培养基上，大肠杆菌S17-1(pRL1063a)的生长都受到抑制，而沙雷氏Z4菌在含有浓度分别为25gg/mL、50gg/mL和75gg/mL的Tc固体培养基上生长正常，但在含有100图4混合培养时间对Tn5转座突变效率的影响设定抗生素选择压力，其中Km浓度分别为100gg/mL、75gg/mL、50gg/mL和25gg/mL，Tc固定不变为25gg/mL.将50gL混合培养后的菌液涂布于对应不同抗生素选择压力的LB固体培养基上，30。培养24h，对长出来的突变株进行统计(图6).结果表明，Km浓度越高，长出的沙雷氏Z4突变菌株就越少；在含25gg/mLKm和25gg/mLTc的筛选固体培养基上，突变株

数量众多,菌落密集难以分开,并且随机挑选突变株再次转接于含Km和Tc的LB固体培养基上，所能长出的突变株很少，说明假阳性突变株多；而在含100gg/mLKm和25gg/mLTc的固体培养基上，突变株数量少.因此，后续实验选择在50gg/mLKm和25gg/mLTc的抗性LB固体培养基上进行筛选.图6图6不同抗生素选择压力对突变效率的影响图7沙雷氏图7沙雷氏Z4菌株生长曲线图8不同沙雷氏Z4菌株生长状态对突变效率的影响3.5沙雷氏菌Z4生长状态对Tn转座突变效率的影响对沙雷氏Z4菌株的生长情况进行监测，每2h测一次OD6oo值，绘制沙雷氏Z4菌株的生长曲线（图7）.结果表明，0—2h内Z4菌株位于迟缓期内（OD6oo范围在0-0.278），3-12h内位于对数生长期（OD600范围在0.400-3.500），13-14h位于平稳期（0D600范围在3.924-4.072）.分别选择OD600为0.200、1.500、4.000时期的沙雷氏Z4菌株与大肠杆菌S17-1（pRL1063a）同比例混合，30。。培养3h，涂布于双抗筛选培养基上，对长出的突变株进行统计（图8）.结果表明，对处于迟缓期内的沙雷氏Z4菌株进行转座突变，其突变效率低于对数生长期以及平稳期的沙雷氏Z4菌株；而对处于对数生长期和平稳期的沙雷氏Z4菌株进行转座突变，均能获得较多的突变株.平稳期的沙雷氏Z4菌株的生长活力不如对数生长期"I,故选择对数生长期的沙雷氏Z4菌株进行转座突变.150-1:Lili0.200 1.500 4.000od60[!3.6群体淬灭差异突变株的筛选在上述优化培养条件下，对沙雷氏Z4菌株进行Tn5转座子插入突变，构建突变体库.利用生物传感器紫色杆菌CV026以及根癌农杆菌KYC55对信号分子C6