兽医实验室人员培训内容

培训内容分为三部分：一、血凝及血凝抑制试验实验操作为高致病性禽流感抗原及抗体测定二、间接血凝试验试验讲解为口蹄疫抗体测定三、ELISA试验原抗体测定。是红细胞凝集试验的简称。利用特异性抗体或病毒血凝素与红细胞表面相应抗原结合而出现凝集现象，用于检测特异性抗体或病毒血凝素。红细胞凝集试验血凝和血凝抑制试验 某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集这种凝集红细胞的现象称为血也称直接血凝反应，当病毒的悬液中先加入特异性抗体,且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制 ,称为红细胞凝集抑制（hemagglutinationinhibiion，HI）反应，也称血凝抑制反应。血凝抑制（HI）试验 禽流感流感病毒颗粒表面的血凝素试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特HA该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法.可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定,也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。HA—HIWHOHAHI红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素，对于其它禽种,也可以考虑选用在调查研究中的禽种红细(Alsevers）液配制称量葡萄糖2。、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0055g、氯化pH15min4℃保存备用。鸡红细胞液的制备21采血 用注射器吸取阿氏液约取至少2只F（如果没有F鸡可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡采血约与阿氏液混合放入装10mL阿氏液的离心管中混匀.2。2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800r/min离心81500~1800r/min8220mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。10％51500～1800r/min8(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。110%1mL，9mL抗原血凝效价测定）3。1在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mLPBS，换滴头.3.2吸取0.025mL病毒悬液加入第l孔，混匀。3310025mL20.025mL311110。025mL弃之，换滴头。0.025mLPBS。每孔均加入0.025mL体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入。下静置40min4℃环境下反应1小时明显的钮扣状沉到孔底。3。7结果判定将板倾斜,观察血凝板，判读结果（见下表。表1：血凝试验结果判读标准表1：血凝试验结果判读标准类别1孔底所见100%红细胞凝集结果++++2红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈+++3红细胞于孔底形成中等大的圈,四周有小凝块4红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块+++-5红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集能使红细胞完全凝集(100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位呈现完全不凝集，否则此次检验无效。血凝抑制（HI））41根据34HAU4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1：2564HAU抗原的稀释倍数应是16除以4。1~110025mL120.05mLPBS。0025mL10.025mL210100.025mL441～114HAU0.025mL，室温（20℃）30min。4.5每孔加入0.025mL体积分数为1％的鸡红细胞悬液混匀，204℃条件下进行，对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。4。6结果判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1HI价小于或等于21og2判定HIHI31og241og2正向间接血凝试验的原理是将可溶性抗原吸附于与免疫无关的载体（红细胞）表面，此吸附抗原的红细胞与相应的抗体结合,在有电下经常被应用到，因此,正确熟练地操作应用，在一些动物疫病的免疫抗体检测、疫病诊断上具有现实意义。正向间接血凝为一种微量的定量反应试验，因而,任何操作环节的纰漏都会使最后判定的结果与正确结论大相径庭.充分理解正向间意义.操作步骤可简化为：①稀释液→②待检血清→③对倍稀释→④血凝抗原→⑤震荡静置→⑥结果判定六个环节。

正向间接血凝试验（IHA)口蹄疫验。抗原与其对应的抗体相遇,在一定条件下会形成抗原复合物，但灵敏性。这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇,适用范围主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。试验器材和试剂96110°V微量移液器（50μL25μL）取液塑咀3。3微量振荡器OO型口蹄疫阴性对照血清3。6O3。7稀释液3.8待检血清(每头约05ml30试验方法加稀释液1—61-9孔；第71—46-71-1250μL。4。2稀释待检血清取1号待检血清50μL加入第1排第1孔,并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧1-2次混匀（250μL3孔……直至第950μL11-9（稀释倍1:16⑷1:32⑸1:641：128⑺1：2561:512⑼。取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排……均按上法稀释，注意！每取一份血清时，必须更换塑咀一个。4。3稀释阴性对照血清在血凝板的第7排第1孔加阴性血清0450μL1：21：41:8⑶、1:166—7稀释阳性对照血清在血凝板的第8排第1孔加阳性血清孔，混匀后从该孔取出50μL1：2-1：4096。加血凝抗原被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加O型血凝抗原(充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μL。4。6振荡混匀将血凝板置于微量振荡器上1-2分钟,如无振荡器，用手轻拍混匀亦可,然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现3715-24。7判定标准移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔,（点，或仅出现“+”凝集（血球大部沉于孔底,边缘稍有少量血球悬浮。。11—58现“+”凝集，第91:128.7牛8注意事项：收到试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果.用不同批次的血凝抗原检测同一份血清时，应事先用阳性血清准确测定各批次血凝抗原的效价,取抗原效价相同或相近的血凝抗原检测待检血清抗体水平的结果是基本一致的，如果血凝抗原效价差别很大用来检测同一血清样品，肯定会出现检测结果不一致。ELISA是酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssayELISA原和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起比例.加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量