张正昊答辩幻灯-PPT幻灯片

资料与方法3讨论5小结

6前言

12结果4研究目的

前言随着基因靶向药物、造血干细胞移植等治疗方法的广泛开展，白血病患者的长期生存率大幅提高，但是仍然有相当大的一部分患者面临着复发的危险。

微小残留病（MRD）是指白血病患者在治疗达到完全缓解后，患者血液细胞计数正常，用形态学方法在骨髓和血液中都不能检测出白血病细胞，但是用更敏感方法能检测出的白血病细胞。

MRD缓解后患者复发常规细胞遗传学虽然也能检测出染色体的异常结构，但检测速度慢检测灵敏性低对于复杂核型分析效果差荧光原位杂交(FISH)技术是近几年发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术。基本原理应用非放射性荧光物质标记克隆化的基因或DNA片段后，与染色体DNA进行杂交，直接从染色体上检查形成杂交部位的荧光信号。

经典t(9;22)细胞信号(DF)能发现常规细胞遗传方法无法检测的基因或染色体重排

速度快、敏感性高，更适合临床使用

12能检测到间期细胞核的染色体异常

3可同时观察数百个细胞，充分了解患者染色体信息4优点研究目的探讨：FISH敏感性是否优于常规染色体核型分析FISH动态随访微小残留病（MRD）的临床意义FISH是否能反映白血病治疗效果FISH是否能预测移植物抗宿主病（GVHD）发生

资料与方法一般资料新疆医科大学第一附属医院血液科2009.10-2010.10收治的白血病患者44例，收集骨髓标本85份，男性27例，女性17例，中位年龄38（14～68）岁。其中汉族35例，维吾尔族4例，回族2例，锡箔族2例，哈萨克族1例。依据骨髓形态学标准确诊CML25例M212例M33例B-ALL2例M01例M4b1例技术路线骨髓标本

治疗前组

阳性患者给予干预性治疗

造血干细胞移植组

药物治疗组

统计学分析,得出结论

检测方法1.预处理：接种培养低渗固定2.老化：2×SSC液30分钟，梯度脱水3.杂交：变性后，37℃温箱16小时以上4.洗涤：0.4×SSC液；2×SSC/吐温5.复染：DAPI复染6.镜检：观察200个分裂间期细胞检测指标1.AML1/ETO双色双融合探针盒2.PML/RARA双色双融合探针盒3.BCR/ABL双色双融合探针4.X/Y红绿双色探针均购于英国Cytocell公司。检测指标：白血病阳性细胞率，结果以百分数表示。表1FISH与常规染色体核型分析样本阳性率及对比分析注：P>0.05一致性检验Kappa=0.819

1.FISH与常规染色体核型对比分析：结果

FISH检测显示15份(17.6%)样本为阳性，染色体核型分析11例(12.9%)为阳性，有4例FISH显示阳性结果的样本，染色体核型分析其中3例结果阴性，1例因中期分裂象极低，而无法分析。2.治疗后患者的动态随访造血干细胞移植后：在移植后1月，2例阳性，给予免疫抑制剂减量等相关治疗后转阴。甲磺酸伊马替尼：治疗后3月内1例阳性，考虑药物起效时间，嘱继续服药，3月后复查转阴。全反式维甲酸：所有检测结果均为阴性。表2造血干细胞移植后各检测时间点之间FISH结果比较

NMRD均值(%)标准差(%)1个月1-6个月6月以上162173.7192.4762.074.69391.55301.336注：组间比较P>0.053.FISH是否能反映白血病治疗效果表3经典方法治疗前后患者FISH均值比较NMRD均值(%)标准差(%)移植后组药物治疗后组治疗前组4612112.8374.95874.2273.03145.083218.7928总数6914.58727.3376注：两治疗组与治疗前组比较P<0.01，两治疗组间P>0.054.MRD与GVHD是否有相关性表4GVHD发生组与未发生组FISH结果比较NMRD均值(%)标准差(%)未发生GVHD组发生GVHD组1264.2081.7505.20692.1852注：组间比较P>0.05

讨论1.FISH具有方法学优势国内外很多研究都对两种检测方法做了比较：如Brown等对69例G显带显示阴性的患者进行FISH检测，结果发现其中3例患者表现出染色体异常。本研究同样在所有G显带阴性的患者中监测出3例染色体异常。

在检测敏感性方面，多数研究表明，FISH的敏感性可以达到10-2-10-3

，本研究应用FISH技术观察200个细胞，敏感性达到0.005，比起常规染色体分析仅仅观察20个细胞，敏感性提高了10倍以上。实验证实FISH技术速度快，灵敏性高，能够检测出常规染色体方法检测不出或无法检测的MRD。

然而，本实验也同样证实：两种方法的检测阳性率比较不具有统计学差别，且两种方法检测的结果具有高度的相关性，所以在没有条件进行FISH检测的情况下，先进行常规染色体核型分析也是必要的。

2.FISH技术对治疗后患者MRD的动态检测在治疗后患者的随访过程中，我们发现了3例MRD阳性患者，在采取了相应治疗后全部转阴。因此，我们认为采用FISH技术在治疗后早期发现MRD，并给予有效治疗可以扭转疾病的不良后果。

在动态随访过程中检测结果持续阴性的病人，临床均未出现复发，说明MRD的结果是监测复发的一个良好的指标。3.FISH结果可以准确反映白血病的治疗效果我们选择了3种国际公认的白血病有效治疗方案的患者，应用FISH检测他们在治疗前后的MRD值。结果反映治疗前后差异具有统计学意义，表明治疗效果明显。这说明FISH对MRD的检测结果，能够准确反映白血病的治疗效果。4.MRD与GVHD的相关性发生GVHD组与未发生GVHD的MRD比较差别不具有统计学意义。依据现有资料，我们尚不能认为GVHD的发生与MRD值具有相关性。虽然国外有文献证实两者之间存在相关性，但考虑本研究中病例样本量有限，还需要更大样本的实验来证实。小结1.FISH检测结果与常规染色体核型分析结果基本一致，但FISH检测速度更快、敏感性更高,且能够检测出部分常规染色体检测不到或无法检测的阳性标本。2.FISH对白血病患者MRD的动态检测对于准确评估白血病状态，预测复发，并指导临床及时给予干预性治疗具有重要意义。3．对3种治疗方法的FISH检测结果显示：在治疗后阳性细胞率表现明显减少，说明FISH能够准确反映白血病的临床治疗效果。4．对移植后患者GVHD的发生与MRD的相关性分析表明两者之间无相关性，但病例样本不足，需要