艾拉莫德临床前药代动力学研究

艾拉莫德（T-614）的临床前药代动力学研高晶1*1，曾1，张2 药物药代动力学与药效动力学国家， 沈阳药学药学院药代，辽宁沈 摘要目的：研究T-614原料在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄、蛋白结合及口服原料和片剂的相对生物利用度；T-6145P450同工酶的体外抑制作用。方法：HPLCigT-6145、10LC/MS/MSigT-61450mg/kg后尿液中的主要代谢转化产物进行了分析；采用高通量P450酶抑制剂筛选试剂盒测定了T-614原料对人P450同工酶CYP2D6、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19CYP3A4的体外抑制活性。结果：igT-6145、1020mg/kg后主要药动学参和（30.896.54）µg/mL，AUC0~t分别为（72.0811.05）（127.5317.68）和（296.2457.10）µg/mL·h；大鼠igT-614原料10mg/kg后在所有脏器组织中均能检测到物质，其中肝、肾、的量最高，脑的量最低；大鼠igT-614原料10mg/kg72h后，粪中的排泄率达到15.75%，而尿与胆汁的排泄率分别为0.836%和0.677%；当质量浓度为5、1020µg/mL时，T-614原料的蛋白结合率分别为（17.2±5.1）%（28.6±7.1）%和（28.910.2）%，平均蛋白结合率为（24.99.2）%。Beagle犬口服T-614原料和片剂5mg/kg，其主要药动学参t1/2Ke分别为（11.101.50）和（9.303.29）h，t1/2Ka分别为（1.180.22）和（1.531.26）h，tmax分别为（4.240.48）和（4.231.75）h，Cmax分别为（0.770.13）和（1.010.27）µg/mL，AUC0~t分别为（12.69尿液中检测到T-614的5种主要代谢物，包括T-614原结构的异构体、苯环羟基化、脱醛基后再羟基化、脱醛料5、10和20mg/kg30%。粪、尿、胆汁中物质的总排泄量低于20%。Beagle犬口服T-614片剂的相对生物利用度为132.5%。T-614对人P450同工酶CYP2D6、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4无抑制作用。T-614在肾艾拉莫德（T-614）；药代动力学；吸收；分布；排泄；代谢；蛋白结合；P450同工酶号 文献标志码 文章StudiesonpreclinicalpharmacokineticsofIguratimod（T-GAOJing1*,ZHIDe-guang1,ZENGYong1,ZHANGPeng2,LIUChang-CenterofNewEvaluationResearch,TianjinInstituteofPharmaceuticalResearch,Tianjin300193,LaboratoryofPharmacokinetics, PharmaceuticalUniversity, ,110016, Objective:Tostudytheabsorption,distribution,excretion,metabolism,andproteinboundingofrawmaterialinvivoofanimalsandrelativebioavailabilityofT-614orallyrawmaterialsandtabletsandtheinhibitoryactivitiesofT-614to5kindsP450Isodynamicenzymes.Methods:UseHPLCmethodtocarryoutpharmacokineticsofT-614inratsatdosesof5,10and20mg/kg,andalsousethesamemethodtoobservetherelativebioavailabilityofT-614micro-powdertabletsbypoadministered5mg/kgtoBeagledog.UsingLC/MS/MSmethodtoyzethemetabolitesofT-61450mg/kginurineofrats.UsingP450HighthroughputInhibitorScreeningKittodeterminetheinhibitoryactivitiesofT-614toP450enzymes,CYP2D6,CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,andCYP3A4.Results:Afterigadministrationof（127.53±17.68）,and（296.24±57.10）µg/mL·h,respectively.AfterigT-614（10mg/kg）torats,T-614inall tissueswasobserved,contentsinliverandkidneywerethe um,andtheminimuminbrain.During72hafteradministrationofT-614（10mg/kg）,excretionamountwas15.75%fromfaeces,butonly0.836%and0.677%fromurineandbile,respectively.At5,10,and20µg/mL,theproteinboundingrateofT-614was（17.2±5.1）%,（28.6±ofT-614andthetabletsinBeagledog,t1/2Kewas（11.10±1.50）and（9.30±3.29）h,t1/2Ka（1.18±0.22）and（1.53±1.26）h,tmax（4.24±0.48）and（4.23±1.75）h,Cmax（0.77±0.13）and（1.01±0.27）µg/mL,andAUC0~t（12.69±T-614intheurinewerefoundtohavefivekindsofmetabolicproducts,includingisomer,hydrogenation,dealdehydelation,andhydrogenationandamino-acetylationofdealdehydelationproductsofT-614.At20－0.0091μmol/LofT-614,theIC50wasover20μmol/LtoCYP2D6,CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,andCYP3A4.Conclusion:AfterigadministrationofT-614（5,10,and20mg/kg）torats,theresultsindicatethatpharmacokineticstudyshowsorderkineticcharacteristics,distributionisbroaderineverytissueofrats,proteinboundingrateislower,andtotalexcretionamountsarelowerinurineandbile.OralrelativebioavailabilityoftheT-614tabletsinBeagledogis132.5%.T-614hasnoinhibitoryactiontoP450enzymes(CYP2D6,CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,andCYP3A4).Themainmetabolismtransformationisisomer,hydrogenation,dealdehydelationandhydrogenationandamino-acetylationofdealdehydelationproductsofT-614.Key 自1992年学者Tanaka等[1]首次艾拉莫德（Iguratimod，T-614，图1）的抗炎作用以直未停止[2]。1993年药物与江苏先声药物研究对T-614进行了联合开发，研究结果表明T-614是一种新型的具有多作用靶点的（DMARD，胞因子和B淋巴细胞，因此它是一种很有前途的新型DMARD[4]。在多中心剂量研究中，口服给药剂量是50mg/d，75mg/d[5]。

图1T-614化学结Fig.1StructureofT-T-614的临床前药代动力学系统研究和生物利用度试验至今未见。根据我国新药申请的技术指南，本课题组应用大鼠和Beagle犬进行了动物定性分析，对人P450同工酶CYP2D6、CYP1A2、CYP2C9CYP2C19和CYP3A442，由药物化药部提供；T-614片，规格：5号2001剂T-614药北地区特种化学试剂开发中心公司经销；乙于技磷量P450抑制剂筛选试剂盒（Hihhrouhputnhibitorgt、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19CYPA4，底物和阳性对照药分别为：（1）AMMC和12.5μmol/L的喹尼丁（quinidine2）CEC2.5（furafylline（3MFCμmol/L的磺胺苯吡唑（sulfaphenazole（4）CEC（tranylcypromine（5BFC125μmol/L的酮康唑（ketoconazole。Wistar大鼠，雌雄兼用，体质量（200±20）g，药物动物室提供。生产合格证：津管动001Beagle（101.0）kg，由新冈动物场提供，合格：沪动合格证字118SPD—10AUV检测器，LabAllianceAS—3000自动进样器，ANASTAR色谱数据工作站；LC-MS分质谱联用仪，有电喷雾离子源（ESI）LCQ据处理系统，并配有直接进样用注射泵和250μL

96孔板（全黑）：Costar公司产品岛津NL—200TPA分析天平，TGL—16C高速台式离心机，安亭科学仪器厂。吸收183651020mg/kg，于给药前0h和给药后0.170.5、1、2、3、4、6、8、12、24h根据血药浓度数据应用3P97药代计算程序进行拟合计算药动学参数，其中Cmax、tmax采用实测值，AUC采用统计矩法计算。 分别于给药后1、4、12h处死一组动物，心、丸、等组织脏器，组织匀浆，测定相应组排泄6，igT-6144～8、8～12、12～24、24～48、48～72h的粪样胆管插管术，收集给药前胆汁作为空白对照,mg/kg4～6、6～8、8～12、12～24h时间段的胆汁，测蛋白结合T-6143质量浓度（5、10、20µgmL）448h，取大鼠血浆200μL，加入DMF200µL，振摇30s，15min，12000/mn10min，20µL色谱柱：C18柱（250mm4.6mm，10µm）；流动相：乙腈-0.1H3PO（40∶60柱温：35HPLC法进行Beagle静脉取血2.1.2项下方法对血样进行处理后,以用3P97药代计算程序进行拟合计算药动学参数,LC/MSn给药及样品处理大鼠igT-614原料50m/kg后，收集24h尿液，用乙腈沉淀后以10000/min10min，取上清液进样分析色谱条件色谱柱为DiamonsilC18柱（200mm4.6mm，5μm，迪马公司）；流动相为乙腈-水-甲酸（55∶450.5；体积流量为0.5mL/min；进样量20μL。质谱条件质谱仪离子源为电喷雾离kV；毛细管温度：200℃，毛细管电压：13V；管透镜补偿电压30V；碰撞气为He；鞘气和辅助气（a.μ.；级质谱（fullscanMS2）和全扫描三级质谱（fullscanMS3）3种方式同时测定。对CYP采用高通量P450CYP450上读出6（%近0%酶上下值（high%inhbiion%inhbition相

对应的样品浓度（highconcentrationlwconcentration，并按以下公式计算IC50。/inhibition-low%inhibition）+lowcon.结果不干扰样品测定，内标和T-614的保留时间分别为6.5和10.2min。结果见图2。血浆用终质量浓度分别为0、0.2、0.5、2、5、10、25、50μg/mL的标准血浆样品进行标准曲线、。其标准曲线的回归方程为：Y=20.764X+μg/mL的回收率分别为（101.4±7.2）%（99.4±1.8）%和（104.0±4.0）%；重现性、稳定性的RSD10%以内，均符合我国现行药代动力学组织心标准曲线方程：Y=X－线方程：Y=23.006X－0.014（r0.9999）线性范围0.1～5μg/mL；肾标准曲线方程：Y22.736X+0.004（r0.9998）线性范围0.2～5μg/mL；脑标准曲线方程：Y=23.917X－0.006（r0.9999）性范围0.05～2μg/mL；肌肉标准曲线方程：Y=0（0.048（r0.9999），线性0.1～8μg/mL；粪标准大鼠血浆中T-614的浓度-时间曲线见图力学参数见表1，3个剂量组Cmax、AUC0~t的相关0.9956），见表2。T-614在大鼠组织中的分igT-61410mg/kgT-614、脾、脂肪、肌肉、胃、脑，结果见图4T-614在大鼠组织中的排

igT-61410mg/kg后，72h后累积排泄率达到总给药量的0.8472h后累积排泄率达到总给药量的15.75胆72h后累积排泄率达到总给药量的0.68%，见表3。T-614的蛋白结率分别为（17.25.1）%（28.67.1）%（28.910.2）%，结果见表4。T-614在大鼠体内的代谢转21igT-61450mg/kgLC/MSn方法初步分离和分析，检测到5种代谢物，结果如图5所示，其中M1为T-614（S）的异构体，其他代M2苯环羟基化、M3脱醛基后再羟基化、M4脱醛基后胺基乙酰化、M521B51E2B51E2521FA-空白血浆；B-空白血浆+T-614+内标；C-igT-614血样；D-igT-614粪样；E-大鼠igT-614尿样；F-igT-胆汁样品;1-内标；2-T-A-blankplasma;B-blankplasma+T614+internalstandard;C-bloodsampleofratsigadministeredbyT-614;D-faecesofratsig图2T-614血浆、粪、尿、胆汁样Fig.2ChromatogramofT-614inplasma,faeces,urine,and表1大鼠igT-614后的主要药代Table1MainpharmacokineticparametersofratsigadministeredbyT-参 单54.90±4.92±1.75±0.13±0.16±0.18±h0.16±0.30±0.58±h5.41±4.31±4.17±h0.81±1.16±1.78±7.83±15.46±30.89±µg·h·mL-mL·kg-1·h-0.08±0.09±0.08±mL·kg-0.61±0.55±0.51±表 Table2 ysisonTable2 ysisonCmaxandAUCatvariousCmax/（µgCmax/（µg·mL-57.83±15.46±30.89±0.9990.99550/ /图3大鼠血浆T-614血药浓度-时间曲Fig. Theserumconcentration-timecurveofT-614afterigadministrationto表3大鼠igT-61410mg/kg后的累计排Table3AccumulativeexcretionrateofT-614afterigadministration10mg/kgto累计排泄率时间粪尿2—46—8——药物评价研究第32卷第1期2009年8 -25表4T-614血浆蛋白结合Table4ProteinboundingrateofT-蛋白结合率517.2±28.6±BeagleBeagleT-614原料5mg/kg和T-6145mg/kg后体内的吸收符合一级动力学模型，血药浓度-时间曲线见图6，药代动力学参数及相对生物利用度见表5。片剂的相对生物利用度为132.50，结果表明微粉化处理可以明显提高生物对人P450同工酶CYP2D6CYP1A2CYP2C9CYP2C19和CYP3A4采用Gentest公司的高通量P450酶抑制剂筛选试剂盒（HighThroughputInhibitorScreening

Kit）T-614对CYP2D6、CYP1A2CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4共5种CYPs676结果显示在本试验条件下，5种已知的专一性抑制验方法的可靠性。表7结果显示T-614对CYP2D6CYP1A2CYP2C9、CYP2C19CYP3A4抑制的IC50均大于20μmol/L，μmol/L表 Beagle犬口服T-614原料与片剂后的主要药动学参Table5PharmacokineticparametersofT-614afterporawmaterialsandtabletstobeagleT-614（5mg·kg-参 单

原 片 0.60± 0.71± 0.06± 0.08±h1.18±1.53±h11.10±9.30±h4.24±4.23±µg·mL-0.77±1.01±µg·h·mL-12.69±16.81±mL·kg-1·h-0.32±0.28±mL·kg-5.08±3.81±OSOCH

ONCHOSandM

SOCH

O OCH

SOCH

OOCHOCOM2 M

OSOCH

ONHO

OSOCH

ONHOM M 图5T-614的代谢转化产Fig.5MetabolismtransformationofT-2.1.00

t/图6Beagle犬口服T-614原料和片剂（5mg/kg）后血药浓度-时间Fig. Theserumconcentration-timecurveofT-614afterporawmaterialsandtabletstobeagle 表6阳性对照药物对CYPs酶活性Qui/（nmol•L-/酶活性Sul/（酶活性Qui/（nmol•L-/酶活性Sul/（nmol•L-Tra/（nmol•L-Ket/（nmol•L- /100/10100533/333111111331121117.202062

表7艾拉莫德对CYPs的抑制实验结Table7InhibitoryactivitiesofT-614to酶活性 ig645100g/kg力学特点。在所有脏器组织中均能检测到药蛋01.50.84068。Beagle645g/kg135。在大鼠尿液中检测到5种64以614的基乙酰化、脱醛基等为主要代谢转化途径。对C26、C12、CYP2C9、CYP2C19和

CYP3A4基本没有抑制作用 614药动学的系统研究的。614动物动学研究结果表明，14在动物体内吸收迅速，消除较缓慢，为将来临床用药及剂型的确定提供了一些参考依据。6440酶无6145TanakaK,ShimotoriT,MakinoS,etal.Pharmacologicalstudiesofthenewanti-inflammatoryagent3-formy-lamino-7-methyl-sulfonylamino-6-phenoxy-4H-1-ben-zopyran-4-one.1stcommunication:anti-inflammatory,gesicandotherrelatedproperties[J].Arzneimit-Forschung,1992,42（7）:935-LiuCX.ReviewonthepharmacodynamicsandactionmechanismofIguratimod,anon-steroidalantiinflam-matorydrug[J].AsianJPharmacodynPharmaokinet,2007,7（1）:33-48.L