第9章 抗生素发酵的代谢与控制课件

第九章抗生素发酵的代谢与控制代谢控制发酵课程授课教师：张侠E-mail：zhx79780@163.com1、次级代谢产物和初级代谢产物的关系2、抗生素产生菌的几种主要代谢调节机制3、细胞生长期和抗生素生产期的相互关系4、抗生素合成的关键酶5、影响次级代谢产物产量的因素及改进措施初级代谢产物：微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质。而产生这些物质的代谢体系称为初级代谢(primarymetabolism)。初级代谢体系具体可分为：分解代谢体系素材性生物合成体系结构性生物合成体系第一节、初级代谢产物和初级代谢次级代谢与初级代谢关系密切，初级代谢的关键性中间产物往往是次级代谢的前体，比如糖降解过程中的乙酰-CoA是合成四环素、红霉素的前体。次级代谢一般在菌体对数生长后期或稳定期间进行，但会受到环境条件的影响；某些催化次级代谢的酶的专一性不高；次级代谢产物的合成，因菌株不同而异，但与分类地位无关；质粒与次级代谢的关系密切，控制着多种抗生素的合成。1、初级代谢与次级代谢的关系从上图可以看出，许多物质处于代谢的分叉点上，例如：CH3CO-SCoA，是葡萄糖糖经HMP、EMP生成的中间物质，经羧化后可形成丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A可用于脂肪酸的合成上，进而又可经多次重复缩合、环化等形成四环素类或其他抗菌素等次级代谢产物，而CH3COSCoA又可以进入TCA循环，这类物质称之为：分叉中间体，还有丙酮酸、草酰乙酸、莽草酸等；这些分叉中间体把微生物的次级代谢和初级代谢紧密地联系起来。一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次级代谢物；不同种类的微生物也能产生同一种次级代谢物；次级代谢产物的合成比生长对环境因素更敏感。如菌体生长，磷酸盐浓度0.3～300mmol/L；产物合成，磷酸盐浓度0.1～10mmol/L；4、次级代谢产物生物合成主要调节机制①.酶合成的诱导调节；②.反馈调节；③.磷酸盐的调节；④.ATP的调节作用；一、概述狭义抗生素:由微生物（包括细菌、放线菌、真菌等）产生的在低浓度条件下，对特异微生物（包括细菌、真菌、立克次体、支原体、衣原体等）的生长有抑制作用的次级代谢产物或化学半合成法制造的相同的和类似的化合物。第二节、抗生素产生菌的代谢与调节广义抗生素：①由微生物产生的抗菌及抗其他病原微生物的物质；②与微生物产物相同的化学合成物。即首先发现于微生物代谢物中，如氯霉素；③以微生物产物为原料，经化学反应所得的衍生物或盐类；④由以上三种来源的驱虫物质。现代抗生素定义是生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性的抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的有机物。历史：1929年，英国费莱明发现青霉素，二战期间，大规模发酵生产，也是世界上最早用于临床的抗菌素。随后，氯霉素（1947年）、新霉素（1949年）、土霉素（1950年）、红霉素（1952年）、四环素（1953年）、头孢菌素（1959年）、喹诺酮类（1980年）……也都相继被发现。根据抗生素的作用机制分类抑制细胞壁合成：青霉素；抑制细胞膜功能：多烯类抗生素；抑制蛋白质合成：四环素；抑制核酸合成：丝裂霉素。根据抗生素的化学结构分类：β-内酰胺类β-lactam：青霉素类penicillins、头孢霉素类cephalosporins；氨基糖苷类aminoglycosides：链霉素、庆大霉素；大环内酯类macrolides：红霉素、麦迪加霉素；四环类tetracyclines：四环素、土霉素；多肽类polymyxin：多粘菌素。在生长期，微生物按一定比例吸收和利用主要营养物质而快速生长。生长期结束时，一种主要营养物质（如P，N或S）可能消耗殆尽或降低到一定程度，成为限制因素，使菌体的生长速度减慢或保持平衡状态，转入生产期。生长期中负责抗生素合成的酶处于被阻遏的状态，如链霉素生物合成中的转脒基酶，青霉素生物合成中的酰基转移酶和苯乙酸活化酶。一旦菌体生长接近生长末期，解除对相关酶的阻遏。为什么抗生素发酵明显分为两个阶段？为什么生长期负责抗生素合成的酶受到阻遏？由生长期过渡到生产期的因素是什么？

从微生物的遗传控制来看，可根据操纵子学说和代谢调节机制来探讨。问题：抗生素合成酶在生长期中被阻遏的可能机制：（1）阻遏蛋白有两个位点，分别与操纵基因和诱导物结合。诱导物结合后，阻遏蛋白就发生变构，不能与操纵基因结合，结构酶解除阻遏，能够合成。生长期中诱导物尚未积累，抗生素合成酶处于被阻遏状态。生长末期，菌体代谢的变化使诱导物积累或外源加入诱导物，解除阻遏，从而合成抗生素。（2）在生长期中，产生了易利用碳源的分解代谢产物，这些产物对生产期的基因产生分解代谢产物阻遏。当分解代谢产物被利用后，才解除对生产期基因的阻遏。例如：葡萄糖的分解代谢产物能阻遏合成放线菌素D的关键酶——吩噁嗪酮合成酶。当葡萄糖耗尽时，该酶才合成。（5）生长期RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用，不能附着在操纵生产期的启动基因上，结果次级代谢产物的合成酶基因受阻遏。菌体停止生长后，酶的结构发生改变，允许RNA聚合酶启动生长期基因的转录作用。

参与抗生素生物合成的酶什么时候出现？其合成如何控制？哪些初级代谢活动能供给抗生素生物合成的前体物质？上述两种系统如何协调以保证抗生素合成高效进行？三、抗生素生物合成的调节与控制酶的诱导及解除阻遏；碳源分解代谢产物调节；氮源分解代谢产物调节；磷酸盐的调节；反馈调节；细胞膜透性的调节；抗生素生物合成的终止。为什么酶的诱导与生长速率有关？微生物生长速率的降低证明微生物的生长受到了外界环境条件（多为营养条件）限制，初级代谢活动不能平衡进行，造成中间产物的积累，诱导了次级代谢合成酶的合成。生长速率降低，可能使已合成的生物大分子转化作用加强，造成具有诱导作用的低分子物质的浓度升高而产生作用。2、碳源分解代谢产物调节碳分解代谢产物调节分为分解产物阻遏和分解产物抑制两种。分解产物的调节机制至今尚不完全清楚（在E.coli中与cAMP有关），可能与具有调节作用的底物的代谢速率有关。在抗生素的生物合成中这两种调节方式都是存在的。葡萄糖对放线菌素、嘌呤霉素的合成产生分解产物阻遏。葡萄糖对青霉素、新霉素合成的影响可能是由于葡萄糖的分解产物抑制作用。抗生素产生菌抗生素产生菌放线菌素杆菌肽头孢菌素氯霉素链霉菌地衣型芽孢杆菌丁头霉菌委内瑞拉链霉菌卡那霉素丝裂霉素链霉素青霉素卡那霉素链霉菌头状链霉菌灰色链霉菌产黄青霉表受葡萄糖抑制的抗生素生产3、氮源分解代谢产物调节（1）氮源与抗生素的合成有些抗生素的合成受氨和其他能被迅速利用的氮源的阻遏。例如：红霉素的合成在氮受限制的情况下可一直进行到发酵液中的氮源耗竭为止。如在生产中添加利用的氮源，红霉素的合成会立即停止。因此抗生素发酵宜选用较难消化的氮源。黄豆饼粉降解成氨基酸或氨的速度很慢，不至于抑制抗生素的合成，因此常作为抗生素工业发酵的氮源。（2）抗生素分子中的氮原子的来源直接前体氨基酸、嘌呤和嘧啶的代谢过程为抗生素的生物合成提供含氮前体。氮转移反应

氨基糖苷类抗生素的生物合成包括多步氮转移反应，包括转氨基，转脒基，转氨甲酰基等。如果这些抗生素合成酶受氮源阻遏，须补加适当浓度的氨基或脒基供体（如Gln，Ala，Glu，Arg等）。丝裂霉素C的生物合成PEP+E-4-P由莽草酸途径合成PEP：磷酸烯醇式丙酮酸E-4-P：赤藓糖-4-磷酸与D-葡萄糖胺有关精氨酸瓜氨酸（3）初级氮代谢物及氨盐的调节某些氨基酸除了直接参与生长和作为次级代谢产物的前体外，还有调节次级代谢物合成的功能。

例如：色氨酸可诱导麦角碱生物合成酶二甲烯基丙基色氨酸合成酶的合成，增加该酶的活力；诺尔思链霉菌谷胺酰胺合成酶受到高浓度铵离子的阻遏。4、磷酸盐的调节磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节抗生素生物合成的重要参数。表现在：过量磷酸盐对四环类、氨基糖苷类和多烯大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生抑制作用。工业生产中常需控制在亚适量。当磷酸盐0.3～300mmol/L时明显促进菌体生长；浓度为10mmol/L或大于10mmol/L时对许多抗生素的合成产生抑制。磷酸盐的调节作用归纳如下：无机磷促进初级代谢，抑制次级代谢无机磷过量，葡萄糖代谢速率加快，胞内DNA，RNA和蛋白质的量增加，呼吸速率上升，次级代谢的合成受阻，或使其生物合成马上停止。无机磷对比生长速率、产物合成速率的影响生二素链霉菌的螺旋霉素生产能力受其生长速率的影响，而生长速率又取决于初磷浓度。螺旋霉素的比生长速率随初磷浓度升高，与比生产速率成反比。无机磷与糖分解代谢途径的影响无机磷浓度增加时磷酸戊糖途径的代谢活性降低，而酵解途径活性增加。HMP途径提供NADH2或前体不足，会影响次级代谢产物合成。磷限制次级代谢产物合成的诱导物的合成磷通过抑制麦角碱生物合成的诱导物色氨酸来抑制麦角碱的生物合成，其原因是高浓度的磷抑制HMP途径，使色氨酸生成减少。过量磷抑制次级代谢产物的前体的生成磷抑制或阻遏次级代谢产物合成所必需的磷酸酯酶

链霉素、新霉素、紫霉素等合成途径的中间物均为磷酸化物，需要磷酸酯酶的参加，该酶受到磷酸的抑制或阻遏。5、反馈调节抗生素的生物合成途径中，反馈调节起着重要作用。抗生素本身的积累起反馈调节作用。

如：青霉素，氯霉素抗生素的前体是初级代谢产物时，初级代谢产物的形成受到反馈调节，会影响抗生素的形成。

如：青霉素前体物是缬氨酸，缬氨酸的合成受到的反馈调节就会影响青霉素的合成。初级与次级代谢间存在分叉中间体，由交叉中间体产生的初级代谢终产物的反馈调节可影响次级代谢产物的形成。分叉中间体主要有：莽草酸，乙酰CoA和α-氨基己二酸。丙二酰CoA既可以在初级代谢中合成脂肪酸，也可以经缩合，环化或闭环生成四环素类或其他类抗生素。如青霉素合成中赖氨酸的反馈抑制。Lys抑制青霉素前体之一的a-氨基己二酸的合成途径的酶的活性或酶量。6、细胞膜透性的调节细胞膜透性的调节是代谢调节的一个重要方面。在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能力的大小是影响青霉素发酵单位高低的一个因素，因为菌体需要足够的硫源来合成青霉素，如输入硫化物的能力增大，硫源供应充足，合成青霉素的量就增多。诱变获得的青霉素高产菌中，有的菌株提高了膜摄取无机硫酸盐的浓度。7、抗生素生物合成的终止抗生素生产周期取决于产生菌的遗传特性和环境条件。在抗生素合成酶形成后抗生素生物合成的速率在一定时间里直线上升，但不同菌种维持时间不同。抗生素合成的终止有以下机制：（1）抗生素合成酶的不可逆衰退

多肽类抗生素合成酶的活力在抗生素生产开始后几小时就开始下降，其机制尚不清楚，短杆菌肽S合成酶失活的机制可能是：酶被蛋白水解酶分解为大小不同的两个亚单位。酶的失活与氧有关，氧使酶的巯基氧化钝化。通入氮可除去氧防止酶失活，指数期供给大量氧而后期维持适当水平也有利于抗生素生成。（2）受自身合成的抗生素反馈调节已证实氯霉素、环己酰亚胺、嘌呤霉素、制霉菌素、霉酚酸和青霉素等抑制自身的生物合成。产生菌的抗生素抑制其生物合成的程度一般与该菌株的生产能力有关。四、人工克服微生物次级代谢

调控作用的限制改进发酵条件：添加诱导物，控制磷的含量，控制葡萄糖的浓度等。诱变育种：回复突变解除反馈调节，抗结构类似物突变株。基因工程在提高生产性能上的应用：强化网络调控机构；改变表达体系；扩增抗生素产生菌的抗性基因；提高编码关键酶的基因剂量；提高转译水平的表达效率；增强重组菌的生长能力；调节性启动子。1、强化网络调控机构途径特定调控基因：基因产物为途径特异的激活蛋白，如使其在对数生长期表达，可使抗生素合成提前。如放线紫红素调节基因：act-ORF4。多效调控基因：多种基因的协调作用。如：天蓝色链霉菌的基因：afsR、afsB和bldA之间的协调作用。强化中间体的表达：波赛链霉菌转入dnrR1和dnrR2多拷贝质粒，可使柔红霉素中间体紫红霉酮大量增加。基因工程在提高生产性能上的应用：2、改变表达体系引入全部结构基因的克隆：

将结构基因克隆，导入生产菌表达。如：将酚霉素（肽类抗生素，含89个L-氨基酸）的结构基因PHM插入质粒中，转化大肠杆菌，可使产量提高。引入通用调节基因：

通用调节基因可以调控多种抗生素的生物合成。如变铅青链霉菌调节基因afsR2可以诱导变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌的两种结构不相干的抗生素——放线紫红素和十一烷基灵杆菌素的生物合成。将afsR2引入S.avermitilis菌可促进阿凡曼菌素生产。3、扩增抗生素产生菌的抗性基因提高菌种对其自身抗生素的耐受能力是高产的先决条件。如使卡那霉素链霉菌编码乙酰基转移酶的基因在卡那霉素链霉菌中表达可使卡那霉素产量比野生型提高4.5倍。4、提高编码关键酶的基因剂量通过定点诱变或增加基因剂量有可能提高关键酶的活性，从而提高产物的表达量。乙酰氧头孢菌素C合成酶是抗生素合成的限制步骤，克隆该酶的基因cefCF并转化到头孢霉中可使头孢菌素C产量提高25％。5、提高转译水平的表达效率重组头孢菌素C的脱乙酰基酶（CAH）基因翻译速率与Shine-Dalgarno（SD）序列和ATG启动子的间隔有关系，13个核苷酸距离翻译速率最快，构建这种质粒可使酶大量表达。6、增强重组菌的生长能力重组菌发酵的产量是由重组菌的生理状态与环境条