植物花粉和花药培养

关于植物花粉和花药培养第1页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五第五章花药和花粉培养

本章主要内容：花粉和花药培养的概念和应用花粉小孢子发育途径花粉和花药培养方法单倍体植株鉴定和染色体加倍

第5章花药和花粉培养第2页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五第一节花粉和花药培养的概念和应用花粉和花药培养的概念花药和花粉培养的历史花粉和花药培养的应用第3页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五花粉和花药的培养(pollenandantherculture)

是指在人工合成培养基上，改变花粉的发育途径,使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂\分化，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。第5章花药和花粉培养单倍体植物(haplobiont)用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。花药培养、花粉培养；胚珠或子房培养（未受精）一、概念第4页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五第5章花药和花粉培养第5页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五异同点：相同点：二者培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。不同点：花药培养属器官培养，花药是植物花的雄性器官，包括体细胞性质的药壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒花粉培养属细胞培养:花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂，比花药培养难度大。第6页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五二、植物花药/花粉培养历史Guha和Maheshwari（1964）曼陀罗花药培养Nitsch和Norreel(1973)烟草花粉培养（游离小孢子培养）Chu（1973）小麦花粉培养（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续成功Konzak(1999)。第7页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五通过花药培养育成的甜椒新品种

：

海花三号

第8页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五三、花药和花粉培养的应用1)诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；第5章花药和花粉培养供体植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。1、作物育种第9页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五常规育种在杂交F5、F6代开始选择；花药培养在F1或F2代进行培养，再人工加倍处理．缩短育种周期3--5年克服后代分离，大大缩短育种周期第二节花药和花粉培养的应用第10页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五

花粉单倍体是纯合配子体，从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是(1/2)n，而从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的概率为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍。2)提高目标基因型的选择效率第11页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株

常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb Aabbab aAbB aabBaAbb aabb第12页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五例子：

二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株

单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。

单倍体

二倍体

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供体亲本AaBb花培

从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是(1/2)n，而从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的概率为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍。第13页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五

3)诱变育种中的作用植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，染色体加倍后成为稳定的纯系。第14页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。2、物种进化研究

第15页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五

单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。3、遗传分析

第16页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五4、构建连锁图谱

双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建。第17页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五能直接表达外源基因，不受显隐性影响5、用于遗传转化

第18页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五第二节花粉孢子体发育途径概念：花粉孢子体发育途径（雄核发育途径）

花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂，在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径，也叫雄核发育途径第19页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五一、花粉发育的阶段花粉离体培养时，雄核发育最适宜的时期一般是第一次有分裂或之前。第20页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五二、雄核发育途径1、A途径小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞

（1）A-V途径由营养细胞重复分裂形成单倍体（2）A-G途径由生殖细胞重复分裂形成单倍体（3）A-VG途径（E途径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C途径营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株2、B途径

小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株第21页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五第22页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五1、雄核发育与P花粉的形成

P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核发育与饥饿处理

饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。三、雄核发育启动机理第23页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五

1、胚状体发育途径

小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育途径

小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。四、花粉植株形态发生方式第24页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五胚状体发育途径部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养第25页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五通过胚状体途径再生形成小植株烟草花药培养第26页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五胚状体发育途径a)球形胚d)

鱼雷形胚芸苔属小孢子培养第27页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养第28页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养第29页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五第三节花粉和花药培养方法一、花药培养二、花粉培养三、白化苗现象四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素第30页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五一、花药培养1、取材

镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。

3、培养

固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。第31页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五二、花粉培养(一)花粉的分离与纯化

1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)

将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2、挤压法

在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。第32页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五1）磁搅拌法

用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；2）超速旋切法

通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4、小孢子纯化对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子3、机械游离第33页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）第34页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五(二)花粉培养方式1、平板培养

花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养

花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养

花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。

第35页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五4、看护培养

利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织第36页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm²）已灭菌的滤纸，放置过夜。3）将分离的花粉接种到已经充分吸收愈伤组织渗透液的滤纸上。4）单细胞分裂形成肉眼可见的小细胞团后，即转移到新鲜培养基上培养，恒温培养，得到单细胞无性系。2.第37页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五看护培养图解第38页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五5、微室培养

利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。6、条件培养基培养

利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。第39页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五微室培养图示：1滴含单细胞培养液周围加石蜡油旁边各加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片平视图凹穴载玻片置培养皿中26~28℃恒温培养第40页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五花粉培养过程取花蕾（镜检）预培养数天取花药消毒分离花粉第一节花药和花粉培养技术接种培养愈伤组织发生第41页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五三、白化苗现象第42页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五（一）白化苗产生的影响因素及机理1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。第43页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五（二）白化苗的控制

通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。

第44页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素（一）基因型

植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。第45页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。（三）花粉发育时期适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)第46页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五芸苔属植物Brassicanapus不同基因型的小孢子产胚率比较Topas

10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,0000.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty10-1000.001-0.01基因型 胚状体数量/106小孢子成苗率（%）第47页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五1、植株生长条件光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。2、植株生长时期一般是开花始期优于开花末期。3、P花粉的频率不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量（二）供体植株生长条件和生理状态

第48页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五随着细胞体积迅速增大，细胞核由中央位置推向一边，即单核靠边期。雄配子体的发育营养细胞生殖细胞精子第49页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五四分体:醋酸洋红染色四分体:Alexander’s染色单核期双核期成熟花粉粒处于不同发育时期的烟草小孢子第50页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五单核晚期液泡第一次有丝分裂后期双核早期双核中期生殖核生殖核营养核第51页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体。

第52页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期玉米第53页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五对不同发育阶段的花药进行培养测试确定最佳小孢子发育时期的形态特征注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化处于不同发育阶段的烟草花芽花粉发育时期的确定第54页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五单核期的确定：

根据细胞观察推测，双核期的花粉中开始积累淀粉，不能使花粉发育成植株。通常采用醋酸洋红或碘化钾染色，再压片镜检，以确定花粉的发育时期。

但是接种前不可能把所有的花粉都进行一次发育时期的镜检，通常是按照花蕾长度大小与花粉发育年龄的相关性，实际操作中取一定大小的花蕾进行的。第55页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五A.通过显微镜下观察确定小孢子发育时期

醋酸洋红染色DAPI

染色第56页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五B.通过花蕾外部特征确定小孢子发育时期

花蕾的外部形态特征与小孢子的发育时期有一定的相关性，花蕾萼裂基部与花冠顶部之差可以作为判断小孢子发育时期的基本指标。

第57页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五预处理是小孢子培养成功的前提条件

预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。

（四）预处理第58页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五1、高低温处理

低温冷藏是最常用的方法

从健壮无病植株采集花蕾，将花蕾用湿纱布包裹放入塑料袋中，置冰箱冷藏。低温处理可阻止小孢子正常分化，使停留于单核状态的花粉显著增多，有利于诱导分化愈伤组织和胚状体。

例子:十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-9℃处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产量降为10.47个。

预处理方法：第59页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五高温处理（热击处理）：

指花药接种后，先在较高温度下（30-35℃）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。

例子:如烟草，32℃高温；小麦，33℃高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力（Touraev，1996）第60页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五2、化学物质处理包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。3、其它包括γ射线、离心、磁场等。

第61页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五（五）培养基

1.基本培养基

主要为N6和MS培养基。MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养；B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养；N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养。Nitsch培养基:适合芸薹属和曼陀罗属。高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。铁盐对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育。

第62页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。在辣椒花药培养中以6%的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高。在番茄花药培养中需要量高达14％。其原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高的缘故，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；

较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。2.碳源第63页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五3、激素

细胞分裂素可促进胚状体形成；

生长素可诱导愈伤组织形成。

细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗4、氨基酸5、活性碳6、pH

第64页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五（六）培养条件

1、温度

物种间有差异，培养温度在25～28℃左右2、光照

光暗交替培养，每天12～18h的光照，光照强度2000～10000lx。3、植板密度植板密度与花培效率有很大的相关性。5×103到2×104／ml密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。第65页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。（七）花药壁因素第66页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五第四节单倍体植株鉴定和染色体加倍一、倍性鉴定二、染色体加倍第67页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五一、倍性鉴定（为什么要进行倍性鉴定？）1、染色体直接计数法通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。2、间接鉴定（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。（3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。第68页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五（4）杂交鉴定法

自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5）分子标记鉴定 包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）第69页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五二、染色体加倍（为什么要进行加倍？）1.自然加倍:

花粉细胞核有丝分裂或核融合可自然加倍，其优点是不会出现畸形，缺点是随机性强，难以掌握和利用。2.人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株。3.愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体植株。

将单倍体植株（孢子体）的茎段、叶柄、根茎切下，置适宜的培养基上使之发生愈伤组织，反复继代后再将愈伤组织转移到分化培养基上，即可获得较多二倍体植株。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定高频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。第70页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五第一节花药和花粉培养技术单倍体植物天然发生的途径：孤雌生殖孤雄生殖无配子生殖也称单性生殖，即卵不经过受精也能发育成正常的新个体

配子体可以不经过配子的结合，而直接产生孢子体的，这种现象叫做无配子生殖第71页，共78页，2022年，5月20日，2点11分，星期五花药和花粉培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。选择合