qPCR快速使用手册

ip™5使用快速指南•如何用iQ™5运行一次实验2.1.1综述创建、选择或修改一个反应程序文件(Protocolfile)创建、选择或修改一个反应板设置文件(PlateSetupfile)。点击“Run”键。以选定的反应板设置文件和反应程序文件进行反应2.1.2反应程序文件(Protocolfile)设置指南用户可以在Workshop模块中，创建一个新的反应程序文件，或是直接选择或修改一个已有的反应程序文件。2.1.2.1选择一个已有的反应程序文件点击“Protocol"键，在弹出的浏览器中选定所要选择的反应程序文件的路径。点击所需的反应程序文件的文件名，此时该文件的具体设置在“SelectedProtocol”窗口中显示出来。注意：iQ™5软件安装后，里面会自带一些我们设置好的反应程序文件作为示例，用户可以直接调用它们。2.1.2.2创建或修改一个反应程序文件在“SelectedProtocol”窗口点击“Edit”键即可对当前的反应程序文件进行修改；在“SelectedProtocol”窗口点击“CreateNew”键即可创建一个新的反应程序文件。无论点击“Edit”或“CreateNew”键，软件都会自动切入“ProtocolEdit”窗口。这个窗口下部有一显示反应内容的表格，用户可以在其中按自己的需求进行修改。修改保温时间和保温温度。“DwellTime”列设置保温时间，“Setpoint”列设置保温温度。如果用户要设置一个10秒的保温时间，那就要在相应格中输入0：10或者0.10。选择荧光数据收集步骤“DataAcquisition”列用于设置荧光数据收集步骤。其中“Real-Time”选项用于荧光定量，“MeltCurve”用于熔点曲线分析。注意：如要进行荧光PCR实验，必须保证程序中至少有一个荧光数据收集步骤。插入循环或步骤在表格中“Cycle”列有数字显示的行，点击该行“Insert”列的"+”，即可完成循环插入，系统默认插入的循环在当前循环之后。在表格中“Step”列有数字显示的行，点击该行“Insert”列的"+”，即可完成步骤插入，系统默认插入的步骤在当前步骤之后。删除循环或步骤点击某Cycle行“Delete”列的“X”，即可将该循环删除。点击某Step行“Delete”列的“X”，即可将该步骤删除。文件保存点击“SaveandExitProtocolEditing”键，在随后出现的“Saveas”对话框中输入程序文件的名称，再点击“Save”键即可完成保存。注意：点击“SaveandExitProtocolEditing"键或“CancelandExitProtocolEditing"键才能退出“ProtocolEdit"窗口。2.1.3反应板设置文件(PlateSetupfile)设置指南在Workshop模块中，用户可以：点击反应板设置文件显示区的“CreateNew”键创建一个新的反应板设置文件；点击反应板设置文件显示区的“Plate”键，在浏览器中选择想要的反应板设置文件的路径并双击其文件名，即可选中该文件；点击反应板设置文件显示区的“Plate”键打开浏览器，选择想要的反应板设置文件的路径并双击其文件名，再点击“Edit”键即可对该文件进行修改；点击“DataFile”键，在随后出现的浏览器中选择数据文件。点击其文件名即可打开其关联的反应板设置文件，再点击“Edit”键即可对其进行修改。在“Notes”栏中输入或修改对该文件的说明。在样品体积(SampleVolume)、封板类型(SealType)、反应容器类型(VesselType)各项设置中输入或修改相应内容。输入或修改文件名。点击“Select/AddFluorophores”键选择本次实验所要使用的荧光染料种类，在软件中每种选中的荧光染料都会用一独特的图标表示。如果“WholePlateLoading”显示在取消状态，请选择该选项选项。注意当用户修改一个反应板设置文件时，该选项为不可用。点击某一样品类型图标。用点击或拖曳来设定该样品类型对应的反应孔。点击某一荧光染料图标。用点击或拖曳来设定该荧光染料对应的反应孔。重复以上7~8两个步骤，直到所有反应孔第一荧光染料对应的样品类型全部设置完毕。如要取消某孔此前的所有设置，点击“DeleteAll”键，再点击该孔。如要取消某孔此前的荧光染料设置，点击“DeleteFluorophore"键，再点击该孔。如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品(Standard)，点击“DilutionSeries”键可设置其原始靶核酸数量。以上为所有反应板设置文件共通的部分，根据反应板设置文件对应类型不同，以下的步骤有所区别。单色荧光检测(Single-ColorExperiments)点击“Save&ExitSetup”键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后缀为".pts”的文件形式保存。多色荧光检测并启用“WholePlateLoading”选项(Multi-ColorExperimentswithWholePlateLoadingSelected)点击第二荧光染料对应的图标。如要取消当前选择的第二荧光染料，点击“DeleteFluophore”图标并点击相应反应孔。点击“PaintCan”图标。用点击或拖曳来设定第二荧光染料对应的反应孔。重复7~8两个步骤，直到所有反应孔第二荧光染料对应的样品类型全部设置完毕。重复15~19的步骤，把第三、第四荧光染料设置完毕(如有需要)。点击“Save&ExitSetup”键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后缀为".pts”的文件形式保存。多色荧光检测并不启用“WholePlateLoading”选项(Multi-ColorExperimentswithWholePlateLoadingDeselected)点击第二荧光染料对应的图标。此时会显示所有反应孔对应第一荧光染料会显示，但其样品类型不会显示。同样在设置第三及第四荧光染料时，此前的荧光染料对应的样品类型也不会显示。如要取消当前选择的第二荧光染料，点击“DeleteFluophore”图标并点击相应反应孔。点击某一样品类型图标。用点击或拖曳来设定第二荧光染料及该样品类型对应的反应孔。重复17~18两个步骤设置其他反应对应第二荧光染料的样品类型。2.1.4反应运行指南点击“Workshop”模块的“Run”键，软件即会切入“Run-TimeCentral”模块的“InitiateRun”界面。2.1.4.1开始运行一次反应在“InitiateRun”界面选择所要使用的反应程序文件和反应板设置文件。选择孔间差异因子计算方式。点击“BeginRun”键。在弹出的“SaveOpticalDataFile”对话框中输入数据文件的文件名。点击“OK”键。2.1.4.2反应运行实时监控在反应运行开始后，软件会切入“MonitorRun”界面，在这里会实时显示反应状况。在反应结束后，会自动弹出“RunStatus”对话框。如点击“Yes”，软件会切入“DataAnalysis”模块显示本次反应的数据。如点击“No”，软件会退回“Workshop”模块。2.2数据分析指南2.2.1综述“DataAnalysis”模块的主要功能就是让用户进行实验数据分析。当用户刚打开iQ™5软件时，“DataAnalysis”模块的切换键显示为灰色不可选。用户只有通过“Workshop”模块的“DataFile”界面选择一数据文件后点击“Analyze”键，即可进入“DataAnalysis”模块。“DataAnalysis"模块分为以下六个功能界面：1.PCRQuant&2.MeltCurve/Peak&3.EndPoint&4.AllelicDisc&5.GeneExpr&6.EditPlatePCRQuant界面设置指南“PCRQuant”界面主要的功能是设置本底和临界阈值等参数来进行PCR定量计算。当这些参数设置完成后，软件就会自动分析出每孔样品的临界循环数。如果用户之前设定了标准品，那么此时软件还会计算出其他各孔样品的原始靶核酸含量。对于多重荧光PCR来说，任一种荧光染料对应的数据均可实现以上分析功能。在本界面中，主要实现以下设置：设置荧光PCR的本底；设置临界阈值；添加或删除需要分析的反应孔。“Workshop”模块中点击“DataFile”键。选择一个数据文件，点击“Analyze”键，软件会自动切入“PCRQuant”界面，并自动设置本底和临界阈值。用户可根据需要，通过“AnalyzeWells”选项添加或删除需分析的反应孔。如果当前界面不是“PCRQuant”界面，请点击“PCRQuant”切换键。第一次进入一个数据文件时，软件会自动设置本底和临界阈值。如果某个数据文件被修改保存后再打开，此时显示的是最近一次修改的内容。按照需要手动调节本底。按照需要手动调节临界阈值。在手动调节时，用户可以随时通过右击曲线图选择“BaselineThresholdfromthecontextmenu”返回软件自动调节模式。MeltCurve/Peak界面设置指南该界面用于分析双链DNA的熔点温度（Tm值）。用户可以通过加入能与双链DNA结合的荧光染料（比如SYBRGreenI等）或荧光标记的杂交探针进行反应，再用该界面进行分析。“Workshop”模块中点击“DataFile”键，选择一个数据文件，点击“Analyze”键，软件会自动切入“DataAnalysis”模块。点击“MeltCurve/Peak”切换键进入该界面，此时熔点曲线图及其峰图就会显示出来。用户可根据需要，通过“AnalyzeWells”选项添加或删除需分析的反应孔。右击熔点曲线图，在弹出的对话框中可以选择参数调整、复制图表、打印图表等等操作。拖曳临界阈值条，将该值调整到合适的位置。用户可以在列表中选择某一峰，然后点击“DeleteSelectedPeak”即可在图中删除该峰。用Shift组合键可以实现群删。点击“EditMeltPeakBegin/EndTemp”键可对默认设置进行修改。点击“RestoreDefault”可以返回默认设置。EndPoint界面设置指南终点法分析，它通过样品相对荧光读数(RalativeFluorescenceUnit简称RFU)终值来对样品的阴、阳性进行定性判断。用户可以采取以下两个方法进入该界面进行终点法分析：在运行时点击“RunEndPoint”键。进入“DataAnalysis”模块后点击“EndPoint”切换键。以下就分别就这两种方法进行说明方法一终点法运行将加好样、封闭完成的反应板放到仪器的加热模块上，合上热盖。在“Workshop"模块中设置好反应板设置文件。点击“RunEndPoint”键。进入“Run-TimeCenter”模块的“InitiateRun”界面，调整完反应程序文件后，点击“BeginRun”注意：进行终点法分析时，其孔间差异因子必须恒定。输入其数据文件名，点击“Save”键保存。当反应运行完成后，软件会自动切入“EndPoint”界面。调整以下参数：分析方法——运用“Nagatives”区分出那些未扩增的反应孔、终点误差及误差参数。用户可根据需要，通过“AnalyzeWells”选项添加或删除需分析的反应孔。在“DefineControl”中定义阴性对照和阳性对照。点击“Recalculate”键，软件进行分析。并在“UnknownsCall”中给出每个未知样本是阴性、阳性还是空白的定性结果。11.点击“Report”键获得分析报告。方法二终点法数据分析“Workshop”模块中点击“DataFile”键，选择一个数据文件。点击“Analyze”键。点击“EndPoint”切换键进入该界面。调整以下参数：分析方法——运用“Nagatives”区分出那些未扩增的反应孔、终点误差及误差参数。用户可根据需要，通过“AnalyzeWells”选项添加或删除需分析的反应孔。在“DefineControl”中定义阴性对照和阳性对照。点击“Recalculate”键，软件进行分析。并在“UnknownsCall”中给出每个未知样本是阴性、阳性还是空白的定性结果。点击“Report”键获得分析报告。AllelicDisc界面指南该界面可以通过与已知基因型样品的数据进行比较得到未知样品的基因型结果。用户可以通过临界循环数或RFU来确定样品是野生纯合子、变异纯合子还是杂合子。“Workshop”模块中点击“DataFile”键，选择一个数据文件。点击“Analyze”键，软件会切入“PCRQuant”界面，系统会自动设置本底和临界阈值，如用户想对其进行修改，参看上文相关内容。用户可根据需要，通过“AnalyzeWells”选项添加或删除需分析的反应孔。点击“AllelicDisc”切换键进入该界面。在“AssignFluorophores”栏中选择各基因型对应的荧光染料。在“DisplayMode”栏中选择统计数据的类型(临界循环数还是RFU)。“ThresholdCycle”代表临界循环数。注意：如一样品在反应中其荧光读数未超过临界阈值，则在散点图上该样品的临界循环数将会表示成反应循环的总数。“RFU”代表相对荧光读数。用户可以通过“SelectCycle”来选择取哪个循环的读数进行分析。选择“AutomaticCall”或者“ManualCall”来进行分析，其中“AutomaticCall”（自动分析）是默认模式。在“AutomaticCall”模式中，软件会自动生成散点图进行分析。“ManualCall”是另一种分析模式，用户可以手动在散点图或数据列表中修改参数。点击“Report”键获得分析报告。GeneExpr界面指南在本界面中，软件会以定量PCR为基础对基因之间的表达进行比较。比如取两个基因进行比较，一个反应孔里有100ngcDNA，另一个只有1ngcDNA，通过定量PCR分析就能得到其相对的关系。iQ™5软件提供了两种基因表达比较模式：相对表达和校正表达。前者直接用样品的CT值进行比较。后者则设定一个恒定量对照基因，用样品与其的对照值进行比较，该基因事先要用细胞数测定、RNA丰度等非PCR方法定好量。比如样品A和B，两者CT值相同。用前者比较就1:1。如果用后者，如果设定相同CT值时，A的荧光染料与对照基因对比值是B的荧光染料与对照基因对比值B的荧光染料的两倍时候，那结果就会是2：1。2.2.5.1相对表达指南根据上文所述，在“PCRQuant”界面调整好定量PCR参数。点击“GeneExpr”切换键，进入该界面。选择“RelativeQuantity”的分析模式。如有需要，可调节相应参数。点击“Recalculate”键获得结果。2.2.5.2校正表达指南根据上文所述，在“PCRQuant”界面调整好定量PCR参数。点击“GeneExpr”切换键，进入该界面。选择“NormalizedQuantity”的分析模式。如有需要，可调节相应参数。在表达设置中选择相应基因。点击“Recalculate”键获得结果。EditPlate界面指南在这个界面里，用户可以对反应板设置文件中的各孔的反应类型进行修改，也可以对标准品对应的原始靶核酸量进行修改。这样，万一用户在实验运行前设置发生错误的话，在这里可以很方便地