生物化学 实验七 酶促反应动力学实验

实验七酶促反应动力学实验

Experimentsonkineticsofenzyme-catalyzedreactions

实验目的了解分光光度法的原理；熟练使用分光光度计；通过实验加深关于PH对酶活性影响的理解；明确酶作用的最适PH的概念及其缘故；学习和掌握米氏常数（Km）的测定原理和实验方法；验证竞争性抑制剂对酶促反应速率的影响。。1.底物浓度[S]2.酶的浓度[E]3.温度[T]4.pH5.酶的激活剂6.酶的抑制剂[I]

酶促反应动力学:影响酶促反应速率(V)的因素:

酶促反应动力学的研究对象是酶促反应速率和各种因素对它的影响。实验原理（一）底物浓度对酶促反应速率的影响

当底物浓度较低时,V随[S]的增大而急剧上升,两者成正比关系.随着底物浓度继续增加,反应速率增加,而幅度不断下降,若继续加大[S]反应速度率就不再增加,达到一个极限值Vmax.Vmax[S](V)[S]与V的关系:米-曼氏方程Vmax--最大速率

Km--米氏常数当V＝1/2Vmax时，KmKm值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度;k2k3

时Km可用来表示酶对底物的亲和力大小，Km与酶对底物亲和力大小成反比。＝［S］Km值的物理意义:Km和Vmax值的测定(1)测定不同底物浓度的反应初速率，以V-[S]作 图可以得到Vmax，再从1/2Vmax，可求得相应的 [S]，即Km值。Vmax½Vmax[S]vKm(2)双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒 数，以1/V-1/[S]作图，得出一直线.Km和Vmax值的测定（二）抑制剂对酶促反应速率的影响

酶的抑制剂：类型可逆性不可逆性竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制

使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质。可逆性抑制作用的动力学比较

作用特点无抑制剂

竞争性抑制非竞争性抑制

反竞争性抑制与I结合组分动力学参数表观Km表观VmKmVmEVmE、ESKmES

本次实验方案酶：碱性磷酸酶AKP底物：磷酸苯二钠

1.观察[S]与V之间的关系2.观察抑制剂的作用3.最适pH

抑制剂：磷酸氢二钠C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=O

H3C-NOH+

C6H5NH3C-NH3C-CC-N=

C=O

H3C-NOK3Fe(CN)6OH-4-氨基安替比林醌衍生物O-P=OONaONa磷酸苯二钠+

H2OAKPOHHO-P=OONaONa+

酚

醌衍生物为紫红色,利用分光光度计测出紫红色溶液的深浅，即光吸收值（A）,A与产物的浓度成正比，而产物的浓度可以代表着酶促反应速率。分光光度法CONCEPT应用分光光度计测定溶液的吸收光谱及其对某一波长光线吸收能力，是对物质进行定性或定量检查的方法。实验原理分光光度法分类紫外与可见光分光光度法比色分析法红外光谱法荧光光度法化学发光分析法了解内容定性检测1.核酸2.蛋白质定量检测紫外分光光度法

比色分析法

许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色在加入适当的显色剂后生成有色物质。

溶液浓度越大，颜色越深。因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。

可见光光度法：用可见光光源测定有色物质也称为比色分析法。SPECTROPHOTOMETER光源单光色器吸收杯光电放大器STRUCTURE分光光度计结构待测液(浓度C)入射光强度I0单色光器出射光强度I光杯厚度L-lgI/I0=KCLA=T(Transmittance,透光率)=I/I0PercentT=I/I0x100(百分透光率)A(Absorbance,消光度,吸光度)=-lgTA=-lgT=-lgI/I0=kcl则即A=kclA为消光度(吸光度)AbsorbanceA=OD（光密度）

=opticaldensityL:比色杯厚度DepthofsolutionC:溶液浓度Concentrationofabsorbingsolution

K:消光系数ExtinctioncoefficientA=-lgI/I0=KCLLambert-Beer定律K、L不变A1=KC1LA2=KC2L即：A1/A2=C1/C2A=KCL

溶液的颜色和光吸收的关系溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它吸收的光互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。光的互补色示意图(/nm)绿500~580nm黄580~600nm紫400~450nm白光青490~500nm橙600~650nm红650~750nm蓝450~480nm青蓝480~490nm操作步骤（一）1.首先按照下表加样基质液即底物溶液（含有磷酸苯二钠）表1（加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准

37℃水浴15分钟

加入0.5Mol/LNaOH1.0ml(迅速混匀，终止反应)

加入0.5％铁氰化钾2.0ml.(氧化作用)，充分混匀

室温放置10分钟

510nm比色，测定OD值(6号管校正零点)加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml

结果处理：以pH值为横坐标,吸光度A为纵坐标绘图,描述pH值对酶促反应速率影响，找出该酶的最适pH。

表2操作步骤（二）1.首先按照下表加样（加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准

37℃水浴15分钟

加入0.5Mol/LNaOH1.0ml(迅速混匀，终止反应)

加入0.5％铁氰化钾2.0ml.(氧化作用)，充分混匀

室温放置10分钟

510nm比色，测定OD值(6号管校正零点)加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml

结果处理：

根据A值,计算不同底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）,以1/V-1/[S]双倒数作图，获得Km值。表3操作步骤（三）1.首先按照下表加样（加入酶液立即计时，迅速混匀）快，准

37℃水浴15分钟

加入0.5Mol/LNaOH1.0ml(迅速混匀，终止反应)

加入0.5％铁氰化钾2.0ml(氧化作用)，充分混匀

室温放置10分钟

510nm比色，测定OD值(6号管校正零点)加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml

结果处理：

根据A值,计算不同底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）,林-贝氏双倒数作图,根据图形判断该抑制剂是对AKP是何种抑制方式。实验结果的处理1.以pH值为横坐标,吸光度A值为纵坐标绘图,描述pH值对酶促反应速率影响，找出该酶的最适pH。2.根据Linewever-Burk方程作图求出Km值。3.根据林－贝氏作图法求出有竞争性抑制剂存在情况下的酶促反应的表观Km值，并判断本次实验为何种类型的抑制作用。[作图]1/[S]1/V-1/Km

根据图获得Km,并判断磷酸氢二钠为何种抑制剂.1/Vmax加样器的正确使用移液管的正确使用（特别注意每种试剂的专用管不可混用）加样量的准确性温度与时间的准确性分光光度计的校准和使用注意事项

开启电源，仪器预热20分钟。波长调至测试用波长（510nm）。将比色皿架处于空白管位置，打开试样室盖，选择“T”档，调节“0”按钮，使数字显示为“0.00”。盖上试样室盖，使光电管受光，调节透过率“100%”按钮，使数字显示为“100.0”。吸光度的测量，将选择开关置于“A”，调节吸光度调零按钮，使数字显示为"0.00"，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。分光光度计使用方法1.比色杯光学表面不能有任何污

损，否则会引起光吸收的增加。3.装液量不能超过2/3,用前润洗.2.比色杯的外表面应以高质量的柔软擦镜纸或绸布擦干净，不能使用易磨损比色杯的滤纸。4.任何液体不能滴落和污染仪器比色杯的使用和清洗1.可以一人做无抑制剂的，另一人做有抑制剂的实验。2.取样量准确,保温准确，加样顺序要一致，每步均混匀。3.同一组实验用相同的比色计。4.作图时,实验点不在同一条直线上时,尽量使各点平均分布在直线的两侧,两图画在同一坐标纸上,便于判断。注意事项实验目的实验原理实验步骤实验结果讨论结论实验报告

酶是由生物细胞合成的以蛋白质为主要成分，对底物起高效催化作用的生物催化剂。

还有一类具有催化作用的核酸-核酶（ribozyme）

酶的概念酶－底物复合物（中间产物学说）1、中间产物学说：

E+SESE+P2、酶与底物结合特点：（1）可逆的、非共价的结合；（2）底物只与酶的活性中心结合；（3）酶与底物结合是通过一种称为诱导契合模式进行的。k1k2k3

酶促反应动力学

概念：研究酶促反应速率及其影响因素。反应速率：单位时间内底物减少或产物增加的速率，常用初速率来衡量。产物0时间初速率酶促反应速率逐渐降低酶促反应的时间进展曲线影响酶促反应速度的因素：底物浓度[S]酶浓度[E]TpH值抑制剂激活剂一、底物浓度对酶促反应速度的影响

vVm0.30.2Vm20.1012345678[S][S]与v关系：当[S]很低时，[S]与v成比例--一级反应当[S]较高时，[S]与v不成比例当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应[S]vKmVm2v=（Vm/Km）[S]v=Vm=K3[E]

底物浓度对酶促反应速度的影响V=Vmax[S]Km+[S]（一）矩形双曲线：(二)米---曼氏方程

（Michaelis-Mentenequation）V=Vmax[S]Km+[S]1、米-曼氏方程解释：当[S]Km时，v=(Vmax/Km)[S],即v正比于[S]当[S]Km时，vVmax,即[S]而v不变（三）Km与Vmax的意义1、Km值等于最大反应速度一半时的底物浓度；2、k2k3

时Km可用来表示酶对底物的亲和力大小，Km与酶对底物亲和力大小成反比；3、Km值是酶的特征性常数之一，Km值范围在10-6~10-2mol/L4、Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比；5、k3为酶的转换数：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变为产物的分子数。1~104/s（四）Km值与Vmax值测定1、双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934）

1=

Km

1+1VVmax[S]Vmax1/V-1/Km01/[S]斜率=Km/Vmax1/Vmax酶的最适pH:酶催化活性最高时的pH。2810pH酶的活性

pH对某些酶活性的影响A:胃蛋白酶;B:葡萄糖-6-磷酸酶四、pH对酶促反应速度的影响AB一些酶的最适pH值

酶最适pH胃蛋白酶1.8过氧化氢酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8五、抑制剂对酶促反应速度的影响抑制作用:直接或间接地影响酶的活性中心,使酶活性降低或丧失。抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物质。一、不可逆抑制（irreversibleinhibition）

抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合,使酶丧失活性,不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性.

SH

SE+Hg2+EHg+2H+

SH

S

SHClSE+As-CH=CHClEAs-CH=CHCl+2HCl

SHClS巯基酶路易士气例1：巯基酶的抑制二、可逆抑制(reversibleinhibition)

抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失,结合是可逆的,能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。可逆抑制类型：竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制（non-competitiveinhibition）反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）(一)竞争性抑制(competitiveinhibition)

概念竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞争同一种酶的活性中心,从而影响E与S的结合。SSEEIIEE+P无I

有I

竞争性抑制的底物浓度曲线v

竞争性抑制作用过程[S]

竞争性抑制的动力学方程:v=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax

竞争性抑制的特征曲线：[I]无[I]1v1[S]1Vmax-1Km(1+)[I]Ki-1Km竞争性抑制的特点：I与S分子结构相似；Vmax不变，表观Km增大；抑制程度取决于I与E的亲和力，以及[I]和[S]的相对浓度比例。（二）非竞争性抑制（non-competitiveinhibition）

概念

抑制剂与酶分子活性中心以外的其它部位结合而抑制酶活性，I和S与酶结合不存在竞争关系。非竞争性抑制作用过程