植物的组织培养

植物的组织培养第二节胡萝卜的组织培养预备任务1人/1个无菌操作台。每组取如下工具放于203室无菌操作台上先行灭菌培养皿、镊子、无菌水和培养基；带1个500mL的烧杯，作废液缸；1个250mL的烧杯装工业酒精150mL；带1个100mL的烧杯。注意放置物品时，先关灭紫外灯，放好后，关上门，再开启紫外灯；

一、组织培养基本原理

全能性

植物体的每一个完整的细胞都拥有形成完整植株的全部遗传信息，在一定的条件下都具有产生一株完整个体的潜在能力。去分化去除外植体原有的分化性状，重新进入新的发育分化状态。组织培养的特点：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。组织培养应用：在理论上是研究细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科的重要手段；在生产上在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛的应用。二、组织培养的方法和步骤

选择原则：根据培养目的、易于诱导、带菌少。

生理状态：幼嫩的组织

取材季节：易成活，生长旺盛季节，内源激素含量高，易分化

植物的长势：生长健壮的组织

外植体大小：应根据培养目的而定胚胎培养或脱除病毒，则外植体宜小；快速繁殖，外植体宜大。一般外植体大小在0.5～1.0

cm为宜。1、培养材料的采集2、外植体的表面消毒处理外植体的表面清洗：洗衣粉清洗，吐温。外植体表面灭菌（一般采用2次灭菌法）先用70%酒精浸10～30s；转到其它消毒溶液，灭菌液要充分浸没材料。无菌水涮洗涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。灭菌剂使用浓度（%）去除难易灭菌时间灭菌效果酒精70-75易0.1-3好氯化汞0.1-0.2较难2-10最好漂白粉饱和溶液易5-30很好次氯酸钙9-10易5-30很好次氯酸钠2（活性氯）易5-30很好过氧化氢10-12最易5-15好抗菌素4-50mg/L中30-60较好3、制备外植体与接种将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊子等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手接触材料。在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种2~4个，防止交叉污染。接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。

三、无菌操作步骤接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开紫外线灯进行杀菌；接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；接种员洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，换穿拖鞋等；上工作台后，用酒精棉球搽拭双手（特别是指甲处）和工作台面；用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。四、本实验—胡萝卜的接种培养把胡萝卜切成约40mm的段；去除表皮，去除木质部和髓；切成约40×20×10mm的条状，共切4块。1、胡萝卜的切块处理皮层韧皮部形成层木质部胡萝卜：把切好的材料，放在100mL的烧杯里，加入75％酒精（现配100mL），浸泡30秒；然后将外植体转入2％次氯酸钠中（100mL烧杯装约70mL次氯酸钠），浸泡25－30分钟；取出材料，放入培养皿，用无菌水洗4－5分钟，重复3次。水稻种子取成熟种子，剥去外壳用70％乙醇浸30秒，转至2％次氯酸钠溶液浸泡30分钟后，用无菌水冲洗4～5次，置无菌滤纸上吸干多余水分。2、消毒和清洗（203无菌室）把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸的培养皿里，去除表面一层，然后切成约8×8×10mm的块；把切好的材料，用烧过的镊子夹到锥形瓶里，3-4块/瓶，包好封口膜和牛皮纸；将培养基放到202，在23~28℃恒温避光条件下培养。3、接种与培养五、注意事项防火实验中要常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全；手上涂酒精，要干后才能接近火源。无菌操作材料经次氯酸钠消毒后，还需严格进行无菌操作；为防止染菌，手要用酒精擦干净，镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。废液处理

实验完后，75%酒精和工业酒精，均应倒回到工业酒精的罐中；升汞有剧毒，小心不要溅出，废液倒回原处；酒精和升汞千万别搞混。六、常见错误举例材料切得过小。材料消毒时间过长。切材料时下面没垫滤纸。镊子、刀在酒精灯上烧过立即放到盛酒精的烧杯里。操作时，手、三角烧瓶在盛材料的培养皿上方活动，容易把菌带到材料上。把接种的切块压入培养基里面。接种时瓶口垂直向上，手、镊子上的脏物掉到瓶里。七、绝不能犯的错误

次氯酸钠回收倒入酒精桶里。八、课后作业及预习组织培养的观察培养期间要进行观察与记录，请拷记录表。课后作业有几种常用的外植体消毒液？主要原理是什么？效果如何？预习叶绿体色素的提取与理化性质的鉴定。材料处理

1）配75%酒精（或配次氯酸钠溶液）；

2）把胡萝卜切成约4cm的段；3）去除表皮、木质部和髓，切成约40×20×12mm方块，4条。消毒和清洗

4）把切好的外植体及配好的酒精，带到203无菌操作台上；5）准备好次氯酸钠；6）将切好的外植体或水稻种子，放在100mL的烧杯里，加入75％酒精，浸泡30秒；

7）然后将外植体或水稻种子转入2％次氯酸钠中，浸泡25~30分钟，不能超过30分钟；

8）取出材料，放入培养皿，用灭菌水洗4~5分钟，重复3次，用滤纸吸干。接种与培养

9）把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸的培养皿中，去