实验五 PCR 扩增目的基因片段及检测

授课教师 学生人数 课题 授课类型 授课方法 教学用具 教学目的 教学重点 教学难点 教学过程一、实验目的1•理解PCR反应的基本原理2•掌握PCR的基本操作技术二、实验原理DNA的变性：在适当的条件下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。DNA的复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火。聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR），是DNA扩增的一种方法，实验中很常用。包括高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应。PCR的目的是大量扩增你所需要的片断。换句话说，就是用人工的方法大量复制DNA。而DNA的复制是以一条链为模板，新合成链按照碱基互补配对进行的。可是有一个问题，DNA的合成必须是前端有一小段序列，他接着这段序列合成，而不能从无到有，凭空合成。它前面这一小段序列就是你所要有设计的引物。5MI 3'5MI 3'■2-A/DNA結欄■(DNAStmcturePCR反应全过程包括3个基本步骤：1•高温变性:在加热的条件下（94r左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂，DNA双链变成单链。2•退火/复性：在降温的条件下（55乜-62©，引物与模板DNA上的目的序列片段结合，通过氢键配对形成杂交双链，形成DNA模板—引物结合物。3•适温延伸：在合适的温度下（68乜-72乜），DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，由引物的3/端为起始点，从5/向3/端延伸,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这种新链又可成为下次循环的模板。每反应一个循环，样本DNA片段数量增加一倍，经30余次循环，DNA产物量可扩增几百万倍。三、实验器材TC-XP型基因扩增仪生产厂家：杭州博日科技有限公司产品型号：TC-XP(0.2mlX96管)2•离心管：0.2ml(30个)3•移液枪：0.2pL、0.5pL、2pL、2.5pL四、 实验材料与药品实验材料：上次课提取的鸡血DNAPCR扩增试剂盒(50次)包括：Buffer(10x)、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物五、 实验试剂Buffer(10x)PCR的反应buffer—般为10Xbuffer。主要作用是提供反应的缓冲体系，维持反应的稳定，给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。组成：Tris-HCl(pH8.3)，KCl有利于引物与模板的退火。MgCl(25mM)2作用：TaqDNA聚合酶活性所必需的，提供离子浓度。通常Mg2+浓度范围为l-5mM。Mg2+可促进Taq酶活性影响反应产量，但浓度过高会增加非特异性扩增。dNTPs(10mmol/L)即脱氧核苷三磷酸，4种脱氧三磷酸核苷酸dATP、dGTP、dTTP、dCTP，是DNA合成的原料。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。Taq酶(5U/pL)具有热稳定性的DNA高温聚合酶，其作用是通过构建磷酸二酯键将脱氧核苷酸聚合形成脱氧核苷酸链,从而形成双链DNA分子。每—步对温度的要求都不—样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受90°C以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷。同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，为保证酶的活性少受影响，应尽量保持-20C环境。引物是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。六、 实验步骤(一)PCR反应混合液的配制：PCR反应体系为25口，在200口离心管中加入下面表1中组分，注意按照顺序加入。表1PCR反应体系PCR反应体系ddH2O16・8yLBuffer(10x)2.5pLMg2+(25mmol/L)2uL引物P1A(2pmol/pL)0.5pL引物P1B(2pmol/pL)0.5pLdNTPs(10mmol/L)0.5uLDNA(50ng-100ng)2pLTaa酶(5U/uL)0.2p,L用手指轻弹管底，使溶液混合均匀。（二）PCR反应程序PCR反应使用的标准程序见表2。表2PCR反应程序阶段温度时间（共1.85小时）—预变性95C10min二变性94C1min退火58C45S35个循环延伸72C1min三再延伸72C5min四保存4C保存反应完成后的PCR产物放在-20°C冰箱内保存备用。七、注意事项在配制PCR反应液时注意吸取每一种药剂后更好枪头，避免交叉污染。配制PCR反应液的整个过程最好在冰上进行。3•加PCR反应液时，枪头要伸入到液面下一小点，防止枪头有残留药液。配制PCR反应液完成后，要轻摇离心管，防止加的药液停留在管壁上。配制PCR反应液时要注意加样的顺序，先加水，有利于反应液的混匀，最后加Taq酶，避免非特异性反应的发生。八、思考题PCR反应中变性-退火-延伸各步反应的目的？为什么要进行预变性和再延伸？预变性是使模板DNA双链完全变性解开。最后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构以保证效果。因为PCR开始的时候，模版是很长的DNA链，如果补进行预变性是无法让双链完全打开的；最后的延伸是为了让taq酶工作地更彻底，就是让你需要扩增的序列完全的被复制，避免产生长短不一的片段。预变性的目的：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。再延伸的目的：因为在循环结束后，体系中的taq酶可能很多正处于复制状态，如果此时降到室温，将会影响最终产率，所以再留出5分钟，以使正在复制中的taq酶能够复制完全，以合成更多的目的分子。我们来看看最后一个循环，先95度，dna在高温下变性，解链成单链分子，然后退