高梁甲基化和微卫星标记遗传连锁图谱的构建

高梁甲基化和微卫星标记遗传连锁图谱的构建【摘要】：高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)是全球第五大类禾谷类作物,具有C4植物的高光效特征,在干旱、半干旱地区的农业生产中占有极其重要的位置,高粱基因组相对较小(750Mbp),遗传多样性丰富,被认为是禾谷类作物比较基因组研究的模式基因组之一。近年来,通过对高粱基因组的研究,在高粱重要基因的定位与克隆、杂种优势利用、分子标记辅助育种等方面都取得了很大进展,然而对其基因组基因表达调控、DNA甲基化位点分布、DNA甲基化水平变化及甲基化遗传模式的研究却相对较少。DNA甲基化是一种表观遗传(epigenetic)现象,是生物在发育过程中基因表达调控的一种重要方式。它不仅参与基因的表达调控、胚胎发育,还参与基因组印迹、细胞分化、X染色体失活和细胞记忆等诸多生物学过程。DNA甲基化可遗传,也可发生逆转,而且存在特定的动态变化模式。在植物的很多生命过程中,DNA甲基化也起着重要的调节作用,为研究植物基因组DNA甲基化位点分布和DNA甲基化水平变化,利用对DNA甲基化敏感程度不同的同裂酶和在AFLP技术基础上发展而来的甲基化敏感扩增多态性技术(methylation-sensitiveamplifiedpolymorphism,简称MSAP),构建植物的甲基化连锁图谱,可以检测全基因组范围内胞嘧啶甲基化位点及模式变化,可以进一步探讨DNA甲基化与植物杂种优势、转基因植物沉默、甲基化模式变化与基因表达调控的关系,为DNA甲基化研究提供理论依据。本研究选用高粱品种B2V4×1383-2杂交组合获得的F2分离群体(共150个体)为材料,以SSR标记为锚定标记,采用SSR和MSAP两种分子标记技术,构建高粱甲基化连锁图谱,并分析其上的甲基化位点,获得如下结果：1.采用MSAP标记可以快速、有效地构建植物基因组甲基化标记的连锁群或连锁图谱。结果表明：1)利用Mapmaker/Exp(Version3.0)作图软件,分析EcoRⅠ／MspⅠ酶切组合所得实验数据,构建出高粱的7个甲基化连锁群,覆盖高粱染色体长度为227.8cM,包含57个EcoRⅠ／MspⅠ酶切位点,在连锁群SBI-02-1(M)上有1个密集的甲基化位点区域。2)利用Mapmaker/Exp(Version3.0)作图软件,分析EcoRⅠ/HpaⅡ酶切组合所得实验数据,构建出高粱的8个甲基化连锁群,覆盖高粱染色体长度为332.2cM,包含64个EcoRⅠ/HpaⅡ酶切位点,在连锁群SBI-02-1(H)上也有1个密集的甲基化位点区域。3)利用Mapmaker/Exp(Version3.0)作图软件,分析2种酶切组合所得实验数据,构建出高粱的10个甲基化连锁群,覆盖高粱染色体长度为401.4cM,包含52个EcoRⅠ／MspⅠ酶切组合位点,50个EcoRⅠ／HpaⅡ酶切位点,在连锁群SBI-Ⅱ和SBI-Ⅸ上各有1个较密集的甲基化位点区域。2.基于同一酶切的高粱亲本间有多态性差异,F2存在分离,分析高粱亲本与杂交种F1的甲基化模式。结果表明：1)高粱亲本之一和杂交种F1有识别相同酶切组合的甲基化位点。亲本之一出现的带在F1中也检测到,有54个这样的甲基化位点被定位到图谱上,其中24个来自于EcoRⅠ／MspⅠ酶切组合,30个来自于EcoRⅠ／HpaⅡ酶切组合。2)高粱亲本之一存在识别EcoRⅠ／MspⅠ或EcoRⅠ／HpaⅡ酶切组合的甲基化位点。但亲本之一出现的带在F1中没有出现,有67个这样的甲基化位点被定位到图谱上,其中33个来自于EcoRⅠ／MspⅠ酶切组合,34个来自于EcoRⅠ／HpaⅡ酶切组合。3)与高粱亲本相比较,杂交种F1基因组的部分位点发生去甲基化反应,甲基化水平降低,而另一些基因位点则表现高度的甲基化,甲基化水平提高。3.MSAP标记也可和其它分子标记相结合,快速、有效地构建对应于该植物染色体基因组甲基化标记的连锁群或连锁图。结果表明：1)以SSR标记为锚定标记,利用Mapmaker/Exp(Version3.0)作图软件,构建出对应于高粱10对染色体的甲基化连锁图。该图谱包含11个连锁群,122个甲基化位点,29个SSR标记位点,覆盖高粱基因组483.6cM。2个标记间的平均图距为3.2cM,平均连锁群长度为22.7cM。在122个甲基化位点中,有89个来源于EcoRⅠ／MspⅠ酶切组合,33个来源于EcoRⅠ／HpaⅡ酶切组合。2)与Menz等(2002年)构建的高粱分子遗传图谱相比较,29个SSR标记中27个标记是2个图谱所共有的,各个标记与连锁群的对应关系及标记在连锁群上的线性顺序基本一致,另有2个标记(Xtxp98、Xtxp160)是Menz等所构建图谱中没有定位的。3)连锁图上存在3个较密集的甲基化位点区域,位于Xtxp296标记、Xtxp69、Xtxp160标记周围。4.对应高粱基因组的10对染色体,分析其上位点甲基化模式的变化。基于同一酶切的高粱亲本间有多态性差异,F2代存在分离,分析高粱亲本与杂交种F1的甲基化模式。结果表明：1)高粱亲本之一和杂交种F1有识别相同酶切组合的甲基化位点,亲本之一出现的带在杂交种F1中也检测到,有51个这样的甲基化位点被定位到高粱染色体上,其中38个来自于EcoRⅠ／MspⅠ酶切组合,13个来自于EcoRⅠ／HpaⅡ酶切组合。2)高粱亲本之一有甲基化位点,亲本中出现的带在F1代中没有检测到,有71个这样的甲基化位点被定位到高粱染色体上,其中51个来自于EcoRⅠ／MspⅠ酶切组合,20个来自于EcoRⅠ／HpaⅡ酶切组合。3)与高粱亲本相比较,在形成杂合体后,杂交种基因组部分位点发生去甲基化反应,甲基化水平降低；另一些位点则表现高度甲基化,甲基化水平提高。通过分析,可以找到高粱染色体上去甲基化位点和高度甲基化位点的分布,为基因表达调控等研究提供更多的信息。5.高粱甲基化连锁图谱的构建能反应整个连锁群范围内胞嘧啶甲基化位点、甲基化敏感区域的分布。研究高粱亲本与杂交种F1的甲基化水平和甲基化模式的变化,有助于进一步探讨植物杂种优势的遗传机理；通过对甲基化热点区域的研究,有助于进一步解析转基因作物目的基因表达沉默的遗传机理,也有助于加深对生物体表观遗传学的研究。在解析与优良基因连锁的甲基化位点的基础上,分析一些重要性状如抗旱、抗病、抗虫及产量等性状,并对其基因进行定位,使鉴定和克隆相关基因成为可能。同时,DNA甲基化图谱的构建可以为作物基因组学的研究提供新的实验数据、新方法和新思路。【关键词】：高粱甲基化MSAP标记SSR标记连锁图谱

【学位授予单位】：山西大学

【学位级别】：博士

【学位授予年份】：2009

【分类号】：S514;Q943.2

【目录】：目录4-14中文摘要14-17英文摘要17-20第一章文献综述20-421.1DNA甲基化20-301.1.1DNA甲基化的功能20-261.1.1.1DNA甲基化调节植物正常生长发育211.1.1.2DNA甲基化在基因组防御中的作用211.1.1.3DNA甲基化调节植物内源基因的表达21-221.1.1.4DNA甲基化与转基因植株的基因沉默有关22-231.1.1.5DNA甲基化与植物的杂种优势有关23-241.1.1.6DNA甲基化与植物的春化作用及开花有关241.1.1.7DNA甲基化在胚胎发育过程中的作用24-251.1.1.8DNA甲基化在遗传印记中的作用251.1.1.9DNA甲基化与X染色体失活有关251.1.1.10DNA甲基化与肿瘤发生有关25-261.1.2DNA甲基化的研究方法26-301.1.2.1高效液相色谱法(HPLC)261.1.2.2甲基化敏感的限制性内切酶-PCR/Southern方法26-271.1.2.3PCR法271.1.2.4.亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法271.1.2.5甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(MS-SNuPE)27-281.1.2.6甲基化特异性PCR法(MSP)281.1.2.7亚硫酸盐测序法281.1.2.8甲基化敏感性斑点分析方法28-291.1.2.9改良的AFLP法(MSAP)29-301.2遗传图谱构建30-351.2.1选择作图亲本及群体31-321.2.1.1选择作图的亲本311.2.1.2选择作图群体31-321.2.2选择作图标记类型及标记数32-351.2.2.1形态标记32-331.2.2.2细胞学标记331.2.2.3生化标记331.2.2.4DNA分子标记33-351.2.2.5构建饱和遗传图谱所需分子标记数351.3高粱遗传图谱研究进展35-401.3.1高粱遗传图谱构建所用的群体361.3.2高粱遗传图谱构建所用的分子标记36-371.3.3高粱遗传图谱连锁群的命名371.3.4我国构建的高粱遗传图谱37-381.3.5较少标记、较少位点的初期的高粱遗传图谱38-391.3.6多种遗传标记、多位点的高粱高密度遗传图谱391.3.7绘制高粱综合性图谱39-401.4立论依据和研究内容40-421.4.1立论依据40-411.4.2研究内容41-42第二章基于MSAP标记的高粱甲基化遗传图谱的构建42-642.1前言422.2供试材料42-432.3实验方法43-532.3.1总DNA的提取和纯化432.3.2甲基化分析43-462.3.2.1获得甲基化差异片段45-462.3.2.2PCR-扩增反应462.3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳462.3.4银染46-472.3.5筛选多态性引物472.3.6扩增47-482.3.7带型统计482.3.8图谱构建48-532.4结果分析53-602.4.1高粱甲基化多态性分析532.4.2EcoRⅠ/MspⅠ酶切组合构建的甲基化图谱53-552.4.3EcoRⅠ/HpaⅡ酶切组合构建的甲基化图谱552.4.42种酶切组合构建的甲基化图谱552.4.5甲基化敏感区域分析55-562.4.6亲本及杂交种间的甲基化类型分析56-602.5讨论60-622.5.1MSAP60-612.5.2不同酶切位点的甲基化图谱61-622.5.3亲本及杂交种间的甲基化模式622.6实验结论62-64第三章基于SSR标记的高粱分子连锁图谱的构建64-773.1前言643.2实验材料64-653.3实验方法65-743.3.1总DNA的提取和纯化65-663.3.1.1实验材料653.3.1.2实验仪器和试剂653.3.1.3实验方法653.3.1.4检测DNA的浓度和纯度65-663.3.2SSR分析66-693.3.2.1SSR标记的引物来源66-683.3.2.2SSR标记的扩增体系683.3.2.3SSR标记的扩增程序683.3.2.4SSR标记引物的多态性筛选68-693.3.3SSR标记的电泳分析69-713.3.3.1配制聚丙烯酰胺凝胶液69-703.3.3.2制备电泳板703.3.3.3SSR标记电泳703.3.3.4SSR标记显色反应70-713.3.3.5实验结果记录713.3.4SSR标记图谱构建71-743.4结果分析743.4.1引物多态性分析743.4.2高粱SSR标记连锁图谱分析743.5讨论74-753.5.1SSR引物多态性差异743.5.2高粱SSR标记图谱与已构建的分子标记连锁图谱的比较分析74-753.6结论75-77第四章基于MSAP和SSR标记的高粱甲基化图谱的构建及甲基化位点的分析77-994.1前言77-784.2实验材料784.3实验方法78-874.3.1.总DNA的提取和纯化78-794.3.1.1.DNA提取方法784.3.1.2.检测DNA的浓度和纯度78-794.3.2.SSR分析79-804.3.2.1SSR标记的引物来源79-804.3.2.2SSR标记的扩增体系804.3.2.3SSR标记的扩增程序804.3.2.4SSR标记引物的多态性筛选804.3.3.SSR标记的电泳分析80-814.3.3.1配制聚丙烯酰胺凝胶液804.3.3.2制备聚丙烯酰胺凝胶电泳板80-814.3.3.3SSR标记电泳814.3.3.4SSR标记显色反应814.3.3.5实验结果记录814.3.4.MSAP分析81-824.3.4.1酶切与接头连接反应81-824.3.4.2预扩增反应824.3.4.3选择性扩增反应824.3.4.4聚丙烯酰胺凝胶电泳824.3.4.5银染显色实验结果记录824.3.5.SSR标记和MSAP标记的高粱图谱构建82-874.4结果分析87-904.4.1引物多态性分析874.4.2高粱SSR标记、MSAP标记甲基化连锁图谱分析87-884.4.3亲本及杂交种间