细胞培养课件

细胞培养技术一、基本概念传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。细胞系（cellline）:原代培养细胞首次传代成功后的细胞，称细胞系。细胞株(cellstrain):从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）瘤株：在动物体内可传代的肿瘤细胞系。ATCCAmericanTypeCultureCollection美国模式培养物收集中心,美国菌种保存中心（一）贴附型大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。

名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起成纤维细胞2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。上皮型细胞（二）悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。三、培养细胞生命期（LifeSpanofCultureCells）

所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。原代培养期传代期衰退期1．原代培养（PrimaryCulture）期：

也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。2．传代期：

初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（DiploidCellLine）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。3．衰退期：

此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（SpontaneousTransformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（InfiniteCellLine），也称连续细胞系（ContinuousCellLine）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。组织培养细胞一代生存期

所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经过以下5个阶段：游离期：

细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

10分钟一4小时贴壁期：

细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）：

这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（MitoticIndex：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。

在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（DensityInhibition），导致细胞分裂停止。四、培养细胞生长的条件1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

渗透压

3无污染

4无毒

（一）实验准备实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管超净台

超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

滤器CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2

。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器纯水仪培养板

培养瓶

常用玻璃器皿清洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干清洁液的配制（二）细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染

合成培养基

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。

人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清。血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定完全培养基的组成基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100单位／毫升培养基的配制

RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g?

青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。

调节pH值至7.2

加血清（终浓度10％）

无菌操作技术体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。【培养前准备】

在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。

【操作野消毒】

无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

【洗手和着装】

原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

五、培养细胞的观察１．肉眼观察培养物颜色及混浊度２．倒置显微镜观察细胞生长状态六、细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数细胞计数：

1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1．悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。七、细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法：1吸光培养瓶中的培养液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。3吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。5吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7将后者放入培养箱中培养。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。八、培养细胞活力测定1．台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；方法：

1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；

2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

2．四唑盐（MTT）比色法

四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值；MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。操作步骤：

（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时；（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。九、细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。

冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序标准程序：

当温度在-25℃以上时，1～2℃/min

当温度达-25℃以下时，5～10℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投入液氮中。细胞冻存方法1．预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；2．取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)；3．加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。十、细胞培养的污染和检测细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。细菌和真菌的污染和检测肉眼直接观察法培养检查法显微镜观察法支原体的污染和检测造成支原体高污染率的原因：

1.支原体大小0.1－0.8um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45um）；

2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；

3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；

4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；

5.研究或操作人员忽略污染问题；

6.已受污染的细胞；

7.已受污染的培养基、血清。支原体之检测：

相差显微镜观察法Hayflick培养基直接培养法原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。

特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。

缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如M.hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。

DNA荧光染色法

原理︰利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst33258）检测支原体污染。此染剂会结合到DNA之富含A-T区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体