冷冻切片技术

第二章生物组织冷冻切片技术冷冻切片技术第1页冷冻切片技术冷冻切片（frozensection）是一个在低温条件下，将动物、植物组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而应用广泛。冷冻切片种类较多，有低温恒冷箱冷冻切片法，二氧化碳冷冻切片法，甲醇循环制冷冷冻切片法等。冷冻切片技术第2页2.1CM

1900介绍CM

1900是徕卡贡献给广大用户用于各种已知低温冷冻切片真正有效仪器。冷冻切片机用来将生物组织标本快速冷冻后，将标本在低温状态下进行微米级超薄切片，为生物组织分析研究提供快速优良组织切片。特点：

·新型CM

1900特色之一是含有大型冷冻室，可冷却到-35°C。·该仪器还提供一个独立样品冷却系统，样品夹温度调整范围到达-10°C到-50°C，可进行不一样类型样品切片，每一样品托有各自独立温度，并可在很短时间内到达所需温度,快速冷冻台保持在-45°C，可同时放多达10个样品，并和一个可连续冷却吸热器相连，可确保样品托上样品快速冷却.高质量，无焊接缝不锈钢冷冻室表面光滑，利于清洁和预防污染。冷冻切片技术第3页规格参数：1.

切片厚度：1至60um2.

最大样品：55

mm直径3.

样品臂前后移动：25

mm4.

样品臂上下移动：59

mm5.

样品臂前后移动速度：0.8mm/秒

冷冻箱温度:0至-35℃6.

冷冻箱降温至:-35℃约4小时7.

除霜功能:以热气9分钟除霜,可自因为二十四小时内设置开始时间8.可随时按制即时除霜.快速冷冻台:至-45℃9.

机身大小(长/深/高):890/730/1200mm10.

机身重量(连机切片):180kg11.

独特双压缩作样品快速冷冻及稳定冷冻切片温度12.

样品快速冷冻:-10℃至-50℃冷冻切片技术第4页2.2操作冷冻切片技术第5页冷冻切片技术第6页冷冻切片技术第7页冷冻切片技术第8页冷冻切片技术第9页冷冻切片技术第10页冷冻切片技术第11页冷冻切片技术第12页冷冻切片技术第13页冷冻切片技术第14页冷冻切片技术第15页冷冻切片技术第16页冷冻切片技术第17页冷冻切片技术第18页冷冻切片技术第19页冷冻切片技术第20页2.3维护冷冻切片技术第21页冷冻切片技术第22页2.4故障排除冷冻切片技术第23页冷冻切片技术第24页冷冻切片技术第25页冷冻切片技术第26页冷冻切片技术第27页冷冻切片技术第28页2.5.冷冻切片一点体会取材，未能固定组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为正方或长方体：1×1×0.5cm；0.5×0.5×0.5cm。取出组织支承器，放平摆好组织，周围滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。将冷冻好组织块，夹紧于切片机持承器上，开启粗进退键，转动旋钮，将组织修平。调好欲切厚度，依据不一样组织而定，标准上是细胞密集薄切，纤维多细胞稀可稍为厚切，普通在5～10um间。冷冻切片技术第29页调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板调整上，这就要求操作者要细心，准确地将其调很好，调校至适当位置。切片时，切出切片能在第一时间顺利地经过刀防卷板间通道，平整地躺在持刀器铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。应视不一样组织选择不一样冷冻度。冷冻箱中冷冻度高低，主要依据不一样组织而定，不能一概而论。如：切未经固定脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中温度不能调太低，在-10--15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪组织时，应调至-25℃左右，切含大量脂肪时，应调至-30℃。冷冻切片技术第30页2.6冰冻切片时注意事项：

防卷板及切片刀和持刀架上板块应保持洁净，需经惯用毛笔挑除切片残余和用柔软纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片经过和附贴地方，假如有残余包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不一样支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不一样编号，依序切片，这么做既不费时也不会乱。冷冻切片技术第31页放置组织冰冻前，应视组织形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，假如胡乱放置，就不能收到很好效果。组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水固定液，在未到达固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了组织，反而增加了切片难度。假如使用未完全固定组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水固定液在组织未经固定前，其中水份也可渗透到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。冷冻切片技术第32页当切片时，假如发觉冰冻过分时，可将冰冻组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。用于附贴切片载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出载玻片与冷冻箱中切片有一个温度差，当温度较高载玻片附贴上温度较低切片时，因为两种物质间温度差异，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一个吸附力，使切片与载玻片牢靠地附贴在一起。假如使用冷藏载玻片来附贴切片，因为温度相同，没有发生上述现象。冷冻切片技术第33页2.7HE染色介绍苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称HE染色法，石蜡切片技术里惯用染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内染色质与胞质内核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中成份着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛技术方法。冷冻切片技术第34页染色结果细胞核被苏木精染成鲜明蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不一样粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。着色情况与组织或细胞种类相关，也随其生活周期及病理改变而改变。比如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则展现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。冷冻切片技术第35页2.7.1试剂配置0.5~1%伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少许蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，假如不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。冷冻切片技术第36页苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列降低)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最终加入冰醋酸和碘酸钠。冷冻切片技术第37页1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。促蓝液：1%浓氨水溶液（1：99）冷冻切片技术第38页2.7.2改进冷冻切片HE染色步骤固定切好切片用95%乙醇95ml+