生物物理2课件

蛋白质分子的特殊运动——折叠分子生物学中心法则

蛋白质折叠问题又被称为第二遗传密码给定一序列，它将怎样折叠成其特定结构？§9蛋白质的折叠蛋白质折叠研究的理论意义几乎所有的生命活动都是由蛋白质完成的

而蛋白质链只有折叠成天然结构才有活性

生命从蛋白质折叠开始！蛋白质折叠研究的应用意义蛋白质工程的医药保健产品市场每年数十亿美元

已知二十多种疾病与蛋白质的错误折叠有关

（老年痴呆症、疯牛病等）蛋白质折叠还是蛋白质组研究的瓶颈之一Scrapie羊瘙痒症Kulu克鲁病疯牛病Prion疾病散发型人克雅病常染色体显性遗传朊蛋白病变异型人克雅病（感染途径疯牛病）PrPsc的增殖目前已知的人类PRION疾病主要有：克-雅二氏病（Creutzfeldt–Jakobdisease，CJD）：自身PrP蛋白发生变异引起的。变异型克-雅氏病（vCJD）：PRION感染。GSS综合征（Gerstmann-StrausslerScheinkerdisease））：由Prnp基因缺陷引起。克鲁病（Kuru）：PRION感染。致死性家族性失眠症（Fatalfamilialinsomnia，FFI）：Prnp基因变异。1976年诺贝尔奖（CarletonGajdusek）：Kuru1997年诺贝尔奖（StanleyPrusiner

）：

PrPscAmyloidosis淀粉样变性病AttributedtoFrerichs,1862Amyloid淀粉状蛋白1854RudolphVirchow变性条件1.温度2.

pH3.盐4.变性剂有机溶剂脲盐酸胍去垢剂尿素：碳酸(全)酰胺O=C(NH2)28M胍：HN=C(NH2)26MNativeProteinDenatured蛋白质的功能决定于它们的天然构象，因而过去研究工作集中在蛋白质的天然构象上，而对变性态没有给予足够重视。近来，人们已知道蛋白质的非天然构象至少在以下三方面有重要作用：1、蛋白质折叠和稳定性2、蛋白质的跨膜运输3、蛋白质的水解和更新小分子蛋白质去折叠转变是可逆的。在周围环境的诱导下，小分子蛋白质发生去折叠，当将环境刺激因素去掉后，去折叠的蛋白质又可以在折叠。一、问题的提出蛋白质的高级结构是由什么决定的？蛋白质如何由一级结构形成高级结构？如何由一级结构预测三级结构？上述提法实际上要解决相同的问题分子内、分子间的相互作用折叠过程中是否存在中间态

绝大多数的小蛋白质的去折叠与再折叠是可逆的

“一级结构不仅为空间结构编码，而且以某种方式规定指导着达到这种空间结构所经历的途径”——蛋白质折叠的密码／立体化学密码／第二密码。折叠密码的复杂性：序列相近的蛋白取相同的空间结构；序列相同的肽段可以取不同的二级结构。 Milestone

Anfinsen对Ribonuclease的研究提出了蛋白质一级结构决定高级结构的假说。Anfinsen'swork,1957-63:formationofnativedisulfidebondsinribonucleaseAandotherproteins.

Keydiscovery:theinformationneededforfoldingiscontainedintheaminoacidsequence.Anfinsen实验

变性蛋白的复性实验从二硫键入手,提出假设,实验验证其正确性:材料:牛胰核糖核酸酶含4对二硫键26-84 40-9558-110 65-72-S-S-交联方式:7x5x3x1=105种,天然只占其中一种牛胰核糖核酸酶Anfinsen实验模型1：空间障碍，只允许一种构象（二硫键配对）模型2：生物合成的结果模型3：先形成了热力学稳定构象，然后形成二硫键加固实验否定了前两种假设，肯定了第三种Anfinsen实验实验一：1.脲变性。RNAase+8M脲+巯基乙醇脲使得肽链展开，酶失活2.透析除脲和巯基乙醇，3.pH~8弱碱性条件，溶液暴露于空气中，重新氧化复性，酶活力重新获得巯基乙醇脲变性过量巯基乙醇导致还原Anfinsen实验实验二1.

脲变性。RNAase+8M脲+巯基乙醇脲使得肽链展开，酶失活2.透析除巯基乙醇，然后通O2，再透析除脲结果：酶活性恢复到~0.01错配的二硫键只需要加一点点巯基乙醇就可复性Anfinsen实验1.由实验一可知，模型２（生物合成的结果）不成立，因为离体条件下复性的蛋白具有全部酶活性（后来又有实验证明体外解折叠是完全的，全人工合成）2.由实验二可知，模型１（空间障碍，只允许一种构象（二硫键配对））不成立，否则，复性的蛋白应该具有几乎全部酶活性3.模型３（先形成了热力学稳定构象，然后形成二硫键加固）能够解释both结果。结论：蛋白质一级结构决定三级结构形成三级结构所需要的所有信息包含在一级结构中。Anfinsen实验Anfinsen实验的启示：1.成功需要一点点运气（简单的单结构域蛋白）2.抓住主要矛盾，善于洞察问题的本质3.

严谨的推理不是得到正确结论的必要条件正确的前提＋正确的推导＝正确的结论正确的前提＋错误的推导＝正确或错误的结论错误的前提＋正确的推导＝错误的结论（大概率）错误的前提＋错误的推导＝正确或错误的结论Model1and2都有实验支持同时代取得的其它一些结果折叠是以结构域为单位进行的。

ribonucleaseA去除5C-末端残基后,蛋白质就丧失了正确形成二硫键的能力。(H.Taniuchi,J.Biol.Chem.245,5459-5468;1970)含有两个或多个结构域的蛋白质，相邻结构域的解折叠是近似相互独立的。LevinthalParadox对一个100个氨基酸残基的小蛋白质链假设：只有主链二面角和可以转动每个二面角只有3个可能值则：总构象数为3200如果：每转动一次时间为10-15秒则：历遍所有构象约需1072年而：宇宙年龄为1.51010三、折叠的动力学考虑有无中间体？最低自由能构象能否达到？折叠过程是怎样的？单一结构域的蛋白质，不存在平衡中间态。两态折叠折叠中间态的发现首先在折叠、去折叠的早期动力学时(快速反应)中发现。(Cytochromec:A.IkaiandC.Tanford,Nature230,100-102;1971;ribonucleaseA:T.Y.Tsong,R.L.BaldwinandE.L.Elson,PNAS68,2712-2715;1971)折叠中间态?无辅基肌红蛋白(Apo-Mb)变性图（圆二色谱CD结果）快速检测蛋白质折叠的方法通过二硫键捕捉中间体

－－捕获二硫键碘乙酸抑制二硫键的生成，在不同的时间加入碘乙酸，得到二硫键数目不同，构象不同的蛋白质，然后利用柱层析分离牛胰蛋白酶抑制剂的二硫键折叠途径中间体限速蛋白质折叠过程的时间尺度多肽链能够采取的构象个数是个天文数字，平均每个Aa可以有10种构象，100Aa的多肽链有10100种可能的构象。从一个构象转变为另一个构象所需最短时间10－13s，则该蛋白尝试所有的构象的时间是1085s=1077y，而人们观察到蛋白质体内、体外折叠的时间是10-1～10-3s.

结论：蛋白质的折叠不是随机尝试所有可能的构象直到遇到某个自由能最低的构象，而是沿着某些确定的途径进行的。蛋白质的天然构象未必是最低自由能的构象，而是动力学途径中所能得到的稳定的构象。LevinthalParadox能量偏移限制了折叠过程中对不合理构象的尝试对蛋白折叠过程的共识

－－两种过程成核：小蛋白多步：大蛋白，以结构域为单位蛋白质折叠的启动疏水塌缩经熔球中间态（moltenglobulestate）二级结构生成框架结构模型特殊作用的启动Disulfidebonds去折叠态中的残留有序结构1、局部肽段形成一些构象单元（螺旋、折叠和转角等）——Motifs——三级结构；

2、肽链内部的疏水作用引起一个塌陷过程，然后经调整，形成不同层次的结构。3、“熔球态”的中间状态。在熔球态中，蛋白质的二级结构已基本形成，蛋白质的整体空间结构也初具规模。在熔球态时，分子立体的结构再作一些局部调整，最后形成正确的立体结构蛋白质折叠的现代研究从头算(abinitio

)预测1D->3D目标：疏水表面埋藏最大，loop熵减最小设计新的蛋白质结构构象病的研究蛋白质错误折叠产生淀粉样纤维，导致构象病，eg:Alzheimer'sandParkinson'sdiseases(J.W.Kelly,NatureStruct.Biol.9,323-325;2002).折叠过程的动力学模拟动力学模拟能够成功的再现折叠过程的细节，例如过渡态的结构(D.Baker,Nature405,39-42;2000)和折叠中间体

(C.Clementi,P.A.JenningsandJ.N.Onuchic,PNAS97,5871-5876;2000)BakerD.等认为，如果多肽链所采取的构象中只有一个低自由能状态，即天然构象，则所有非天然构象多肽链将遵循经典热力学假说，由高能态向低能态转变，最终形成天然构象。但有些蛋白，天然构象也许并非是多肽链自由能最低的构象或唯一的低能构象，多肽链采取非天然的构象也很稳定，而这两种构象之间转变需要克服很高势垒而难以实现，那么蛋白质在折叠过程中就会有两种途径的竞争，一种是正确折叠形成天然构象，一种是错误折叠形成非天然构象。蛋白质之所以能够形成正确的构象，是由于一些因素在蛋白质折叠的动力学过程中起驱动作用。“辅助性组装学说”相对于“自组装”学说，认为蛋白质多肽链的正确折叠和组装需要其他蛋白质分子的帮助，分子伴侣与折叠酶一起，构成了两种重要的辅助折叠分子。折叠酶折叠酶催化蛋白质折叠过程中共价键的异构化，主要有有PDI和PPI。PPI，脯胺酰顺反异构酶PDI，二硫键异构酶四、分子伴侣（chaperone）

许多蛋白质的多肽单体在离体条件下能折叠、组装成具有生物学功能的聚合体，但在体内绝大多数新生肽三维结构的形成，需要一类称为分子伴侣的辅助蛋白的存在。分子伴侣是能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等的一类蛋白。在动物、植物、细菌内广泛分布和存在，其功能是介导其它蛋白质的折叠和装配，而本身却不是最终功能蛋白质分子的组成部分。定义一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份.分子伴侣的特征

从参与促进一个反应而本身不在最终产物中出现这一点来看，分子伴侣具有酶的特征。但从以下三方面来看，分子伴侣和酶很不同。1、分子伴侣对靶蛋白没有高度专一性，同一分子伴侣可以促进多种氨基酸序列完全不同的多肽链折叠成为空间结构、性质和功能都不相关的蛋白质。2、它的催化效率很低。行使功能需要水解ATP，以改变其构象，释放底物，进行再循环。3、它和肽链折叠的关系，是阻止错误折叠，而不是促进正确折叠。4.多能性（胁迫保护防止交联聚沉，转运，调节转录和复制，组装细胞骨架）5.进化保守性分子伴侣的分类伴侣素家族(Charperonin,Cpn)GroE(Hsp60)家族和Tric家族热休克蛋白70家族(Hsp70)热休克蛋白90家族(Hsp90)其它种类的