分子发光分析法

分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(MolecularLuminescence)。依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。本章讨论分子荧光(MolecularFluorescence)、分子磷光(MolecularPhosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法 。第一节 荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于 1864年提出可将荧光作为一种分析手段。 1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。 进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态 (2S+1=1)，基态单重态以 S0表示。当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以 S1、S2表示。处于电子激发态的分子是不稳定的，它会很快地通过无辐射跃迁和辐射跃迁释放能量而返回基态。辐射跃迁发生光子的发射，产生分子荧光和分子磷光；无辐射跃迁则以热的形式释放能量，包括振动弛豫(VR)、内转化(ic)和体系间窜跃(isc)等。图5-1为分子内所发生的各种光物理过程的示意图。图5-01分子内的光物理过程.doc图5-01分子内的光物理过程.JPG图5-1分子内的光物理过程A1,A2-吸收F-荧光P-磷光ic-内转化isc-体系间窜跃VR-振动弛豫振动弛豫是在同一电子能级中，分子由较高振动能级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁。振动弛豫过程的速率极大，在10-14～10-12s内即可完成。内转化是相同多重态的两个电子态之间 (如S2→S1,S1→S0)的非辐射跃迁。内转化过程的速率在很大程度上决定于相关能级之间的能量差。相邻单重激发态之间能级较近，其振动能级常发生重叠，内转化很快。因此，通常不论分子被激发到哪一个电子激发态，在10-13～10-11s内经内转化和振动弛豫都会跃迁到最低电子激发态的最低振动能级上。基态(S0)和第一电子激发单重态(S1)之间的能量差较大，因而S1→S0内转化的速率相对要小得多，使得第一电子激发态有相对较长的寿命。处于第一电子激发单重态最低振动能级的分子，以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级时，就产生了分子荧光。由于激发态中存在有振动弛豫和内转化现象。使得荧光的光子能量比其分子受激发所吸收的光子能量低。因此，荧光波长 λ总比激3发波长λ或λ要长。而且，不论电子开始被激发至哪个能级，1 2都将只发射波长为 λ的荧光。荧光的产生在 10-9～10-6s内完成。3体系间窜跃是指不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁。当分子的第一、二电子处于激发三重态(2S+1=3)时，以Tl、T2表示。单重激发态Sl的最低振动能级同三重态T1的较高振动能级重叠。因而S1→T1的体系间窜跃就有了较大的可能性。第一电子激发单重态的分子经体系间窜跃到达三重态后，快速振动弛豫至最低振动能级 v=0上。此时有两种途径返回基态，一是辐射跃迁发出磷光，二是体系间窜跃。由于改变电子自旋的跃迁属禁阻跃迁，因而跃迁速率小得多，使得三重态有较长的寿命，约为10-3～10s(二)荧光效率及其影响因素1．荧光效率 物质在吸收了紫外和可见光后， 激发态分子是以辐射跃迁还是以非辐射跃迁回到基态，决定了物质是否能发荧光。通常以荧光效率(或荧光量子产率)来描述辐射跃迁概率的大小。荧光效率定义为发荧光的分子数目与激发态分子总数的比值，即荧光效率f发荧光的分子数—1)(5激发态分子总数荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质发射的荧光也就越强，若以各种跃迁的速率常数来表示，则fKf(5—2)KfKi式中：Kf为荧光发射过程的速率常数，∑Ki为非辐射跃迁的速率常数之和。一般来说， Kf主要取决于物质的化学结构。而∑Ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。具有分析应用价值的荧光化合物，其荧光效率在 0.1～1之间。2．荧光与分子结构的关系 首先，物质只有能够吸收紫外—可见光。才有可能发荧光。因此，发荧光的物质分子中必须含有共轭双键这样的强吸收基团，且共轭体系越大， π电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光。大部分能发荧光的物质都含有一个以上的芳环，随共轭芳环增大，荧光效率提高，荧光峰向长波长方向移动。如萘的荧光效率为 0.29，荧光波长为310nm，而蒽的荧光效率为 0.46，荧光波长为 400nm。其次，分子的刚性平面结构有利于荧光的产生。以荧光黄和酚酞为例，二者结构十分相似，但荧光黄在 0.1mol·L-1NaOH溶液中的荧光效率高达 0.92。而酚酞由于没有氧桥，分子不易保持刚性平面，不易产生荧光。刚性平面结构可以减少分子的振动相碰撞去活的可能性。一些有机配位剂与金属离子形成螯合物后荧光大大增强，这也可用刚性结构的影响来解释。例如，8—羟基喹啉本身荧光较弱，与Mg2+形成螯合物后则是强荧光化合物。再如，滂铬BBR本身不发荧光，与Al3+在pH＝4.5时形成的螯合物发红色荧光。Al3+-滂铬BBR螯合物.JPG取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。给电子取代基如―OH、―NH2、―NR2和―OR等可使共轭体系增大，导致荧光增强；吸电子取代基如―COOH、―NO和―NO2等使荧光减弱，例如，苯胺和苯酚的荧光较苯强，而硝基苯为非荧光物质。随着卤素取代基中卤素原子序数的增加， 物质的荧光减弱，而磷光增强。这种所谓的“重原子效应”是由于重原子中能级交叉现象严重，容易发生自旋轨道偶合作用，使 S1→T1的体系间窜跃显著增加所致。3．环境因素对荧光的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质。一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大。例如，奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为 1、30和1000。温度对于溶液荧光强度的影响非常显著。通常认为，辐射跃迁的速率基本不随温度而变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著地增大。因此，对于大多数荧光物质，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光影响比荧光更大。大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大。共轭酸碱两种型体具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种型体，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长，例如：不同共轭体系的荧光 .JPG不同共轭体系的荧光 .doc溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。由于氧分子的顺磁性质，溶液中溶解氧的存在，使激发单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率降低。其它顺磁性物质也有这种作用。(三)荧光强度与溶液浓度的关系根据荧光效率的定义，荧光强度 If应为所吸收的辐射强度Ia与荧光效率φf的乘积：If=φfIa=φf(I0-I)由于AI0-AlgI=I0·10I可得If=φfI0(1-10-A)23Iff-2.3A2.3A(5―3)I02.3A-3!2!如果溶液很稀，吸光度 A<0.05，方括号中其它各项与第一项相比均可忽略不计，则上式可简化为If=2.3φfI0A=2.3φfI0kbc(5—4)可见，当A<0.05时，荧光强度与物质的荧光效率、激发光强度、物质的摩尔吸收系数和溶液的浓度成正比。对于一给定物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与溶液浓度有关：If=Kc (5―5)上式为荧光定量分析的基本依据。以荧光强度对荧光物质的浓度作图，在低浓度时，呈现良好的线性关系。当荧光物质的溶液浓度较高时，荧光强度同浓度之间的线性关系将发生偏离，有时甚至随溶液浓度增大而降低 (图5-02荧光强度与溶液浓度的关系.JPG图5-2)。导致标准曲线弯曲的原因，除了式(5-3)中的高次项影响外，还存在猝灭效应。荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质、称为荧光猝灭剂。前面提到的氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂。由荧光物质自身引起的荧光强度减弱的现象称为荧光自猝灭效应。经常遇到的自猝灭现象有两种。一种是当荧光物质发出的荧光通过溶液时被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。另一种是由于激发态分子之间的碰撞，导致非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。很显然，不论哪种情况，增大荧光物质的浓度均会使荧光猝灭效应增强，从而导致标准曲线向浓度轴弯曲，即使荧光强度降低。(四)荧光的激发光谱和发射光谱以不同波长的入射光激发荧光物质，并在荧光最强的波长处测量荧光强度，以激发波长为横坐标。荧光强度为纵坐标绘制关系曲线，便得到荧光激发光谱。激发光谱实质上就是荧光物质的吸收光谱。若固定激发光的波长和强度不变，测量不同波长下的荧光强度，绘制荧光强度随波长变化的关系曲线，使得到荧光发射光谱，简称荧光光谱。激发光谱和荧光光谱是荧光测定时选择激发波长和荧光测量波长的依据，也可用于鉴别荧光物质。三、荧光分析仪器常用的荧光分析仪器也是由光源、单色器、液槽、检测器和信号显示记录器五部分组成。它与分光光度计比较主要差别有两点。第一，荧光分析仪器采用垂直测量方式，即在与激发光相垂直的方向测量荧光 (图5-03荧光分析仪器示意图 .doc图5-03荧光分析仪器示意图.JPG如图5-3所示)，以消除透射光的影响。第二，荧光分析仪器有两个单色器，一个是激发单色器，置于液槽前，用于获得单色性较好的激发光；另一个是发射单色器，置于液槽和检测器之间，用于分出某一波长的荧光，消除其它杂散光干扰。(一)光源荧光测量中的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度。在荧光计中，常使用卤钨灯作光源；在荧光分光光度计中，通常采用高压汞灯或氙弧灯作光源。高压汞灯是利用汞蒸气放电发光的光源，其光谱略呈带状，以 365nm的谱线为最强。荧光分析中常使用 365nm、405nm和436nm三条谱线。高压氙弧灯是荧光分光光度计中应用虽广泛的一种光源。氙灯是一种短弧气体放电灯， 工作时，在相距约8mm的钨电极间形成一强电子流 (电弧)，氙原子与电子流相撞而解离为正离子，氙正离子与电子复合而发光，其光谱在 250～800nm范围内呈连续光谱。此外，作为一种新型荧光激发光谱，可调谐染料激发器显示出了巨大的优势。(二)单色器荧光计的单色器是滤光片， 因而荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。荧光分光光度汁一般采用两个光栅单色器。荧光分光光度计既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。(三)检测器荧光的强度一般较弱，要求检测器具有较高的灵敏度。荧光计采用光电管作检测器，荧光分光光度计采用光电倍增管作为检测器。荧光分析之所以具有比吸收光度法高得多的灵敏度，是由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，而且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定灵敏度提高。吸收光度法则不然，它测定的是吸光度，不管是增大入射光强度 I0，还是提高检测器的灵敏度，都会使透过光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值并不会改变，因而灵敏度不能提高。四、荧光分析法的应用(一)无机化合物的分析大多数无机离子与溶剂之间的相互作用很强，其激发态多以非辐射跃迁方式返回基态，发荧光者甚少。然而很多无机离子可以与一些有机化合物形成有荧光的络合物，利用这一性质可对其进行荧光测定。目前采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70种，其中较常采用荧光法测定的元素有铍、 铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物。它们通常含有两个或两个以上的官能团，能与金属离子形成五元环或六元环的螯合物。由于螯合物的生成，分子的刚性平面结构增大，使原来不发荧光或荧光较弱的化合物转变为强荧光化合物。例如，荧光镓在 pH＝5.0时与Al3+形成发射黄绿色荧光的络合物 ,pH＝3.0时与Ga3+形成发射黄色荧光的络合物；安息香在碱性介质中与硼酸盐形成发射绿蓝色荧光的络合物，与Zn2+形成发射绿色荧光的络合物；桑色素在碱性溶液中与Be2+形成发射黄绿色荧光的络合物等。荧光分析中常用的另一类络合物是三元离子缔合物。 例如，罗丹明B为阳离子荧光染料， Au3+、Ga3+、Tl3+等阳离子首先与Cl-、Br-等卤素离子形成二元络阴离子， 再与罗丹明B缔合形成荧光化合物。再如，曙红为阴离子荧光染料， Ag+与邻菲咯啉形成的二元络阳离子，再与曙红缔合后可使其荧光猝灭，由荧光降低的程度也可对 Ag+进行分析。荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。除了上述Ag+外，可采用荧光猝灭法间接测定的离子还有 F-、S2-、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+等。(二)有机化合物约分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发生荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。如丙三醇与苯胺在浓硫酸介质中反应生成发射蓝色荧光的喹啉，据此可以测定0.1的丙三醇。芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光，可以直接用荧光法测定。如在微碱性条件下，可测定0.001μg·mL-1以上的对氨基萘碘酸及 0～5μg·mL-1的蒽。对于具有致癌活性的多环芳烃。荧光分析法已成为员主要的测定方法。为了提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后再进行测定。例如， 水杨酸与铽形成络合物 后。荧光增强，测定灵敏度提高。再如，糖尿病研究中的重要物质阿脲 (四氧嘧啶)与苯二胺反应后，荧光增强，可用于测定血液中低至10-10mol阿脲。在生物化学分析、生理医学研究和临床、药物分析领域，许多重要的分析对象，如维生素、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化物、酶和辅酶等，均可用荧光法分析。由于荧光法的高灵敏度，它还用于生理过程中生物活性物质之间的相互作用、生化物质的变化以及反应动力学过程的研究和监视。第二节 磷光分析法一、概述磷光是分子从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射。磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合和进行定量分析的一种方法。但是在1975年以前。绝大多数磷光分析工作都是在低温条件下进行的，后来相继出现了一些室温磷光分析方法，如固体表面室温磷光法、胶束增稳室温磷法和敏化室温磷光法等分析方法，使磷光分析法在药物分析、临床分析等领域的应用日益发展，并与荧光分析相互补充，在有机定量分折中发挥出愈来愈重要的作用。二、基本原理(一)产生和磷光强度前已述及，磷光是由处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。由于分子的第一电子激发三重态 (T1)的能量低于其第一电子激发单重态， 因此，磷光辐射的波长比荧光更长。三重态T1向基态Ｓ0属自禁阻跃迁。跃迁速率小，使得三重态稳定性大，因而磷光比荧光有长很多的寿命。 当激发光停止后，荧光立即消失，而磷则将持续一段时间 (10-4～10s)三重态的寿命较长，使得激发态分子发生 T1→S0体系间窜跃这种非辐射跃迁的概率较大。因而，磷光物质在室温溶液中产生的磷光一般都比较弱。当磷光物质浓度很小时，磷光强度 Ip与磷光物质浓度之间的关系为Ip=2.3φpI0kbc (5—6)式中：φ为磷光效率，p

I0

为激发光的强度，

k为磷光物质的摩尔吸收系数，

b为试样池的光程。在一定的条件下，

φ、I、p pk、b均为常数，因此式 (5—6)可写成Ip=Kc根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线(二)温度对磷光强度的影响溶液中物质的磷光强度与温度有密切的关系。在室温条件下，溶剂分子热运动比较剧烈，绝大多数处于激发三重态的物质分子均会与溶剂分子碰撞而失活，磷光很难产生。随着温度的降低，分子热运动速率减慢，磷光逐渐增强。当溶液在液氮中冷冻至玻璃状时，某些物质可以产生很强的磷光。低温磷光分析就是基于这一原理而建立起来的。对于吲哚、色氨酸和利血平等物质，其低温磷光分析法有比荧光法更高的灵敏度。(三)重原子效应使用含有重原子的溶剂 (如碘乙烷、溴乙烷)或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度，这种效应称作重原子效应。前者称为外部重原子效应，后者称为内部重原子效应。重原子效应的机理是，重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用。从而使 S1→T1的体系间窜跃概率增大。有利于增大磷光效率。利用重原子效应是提高磷光分析灵敏度的简单而有效的手段。目前应用较多的除重原子溶剂外， 还可采用碘化物，Ag+盐、Pb2+盐和Ti+盐也有应用。(四)室温磷光在一般情况下，溶液中磷光物质的室温磷光太弱。不能用于分析。当向溶液中加入适当的表面活性剂时，由于形成了表面活性剂胶束，改变了磷光物质的微环境， 增强了定向约束力，从而减少了磷光分子与溶剂分子的碰撞概率。增加了三重态的稳定性，导致磷光强度显著增大，称此为胶束增稳室温磷光。当磷光物质吸附于某些固体表面时，分子的刚性增加，三重态的碰撞去活化概率大大减小，也可在室温下产生较强的磷光。由此又产生了固体表面室温磷光分析方法。三、磷光分析仪器磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，也是由光源、激发单色器、液槽、发射单色器、检测器和放大显示装置所组成。由于分析原理上的差别，磷光分析仪器有些特殊部件。1．试样室 测定低温磷光一般在液氮温度 (77K)下进行，盛放试液的试样池需放置在盛液氮的杜瓦瓶内。固体表面室温磷光分析则需特制的试样室。2．磷光镜 有些物质既产生荧光，又能产生磷光。为了在有荧光现象的体系中测定磷光，常采用一种叫磷光镜的机械切光装置，利用荧光与磷光寿命的差异消除荧光干扰。现代的磷光分析仪多采用脉冲光源与程控检测相结合的时间分辨技术。四、磷光分析法的应用磷光分析法在药物分析、临床分析及环境分析领域得到了一定的应用。它与荧光法互相补充，已成为痕量有机物分析的重要手段。低温磷光分析已应用于萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃以及含氮、硫和氧的杂环化合物分析，还用于阿司匹林、柯卡因、磺胺密啶、维生策 K、B6、E等许多药物的分析。固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物快速灵敏的分析手段。胶束增稳室温磷光分析已用于萘、芘、联苯的分析。第三节 化学发光分析法一、概述化学发光分析是利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。在化学发光中，发光物质所需的激发能既不是光。也不是热和电，而是由化学反应过程中所提供的化学能。化学发光现象自19世纪中期就为人们所熟知，但应用于分析化学却是20世纪五六十年代的事。1970年左右。化学发光法被推荐作为监测空气污染物的方法。70年代后，液相化学发光分析得到快速发展。目前，这一方法已广泛地应用于痕量元素分析、环境监测以及生物医学分析等领域，成为一种重要的痕量分析手段。化学发光分析具有下列突出特点：(1)灵敏度很高。例如，用荧光素酶和腺苷三磷酸(ATP)的化学发光反应，可测定低至2×10-17mol/LATP;利用鲁米诺化学发光体系测定Cr3+,Co2+等离子的检出限也低至10-12g/mL。(2)测定的线性范围宽。一般有 5~6个数量级。(3)仪器设备简单。化学发光分析仪没有激发光源，由于不存在杂散光和散射光等引起的背景干扰，并且检测的是整个光谱范围内的发光总量，因而也不需要单色器。(4)分析速度快。流动注射化学发光分析每小时可测定 100个以上的试样。二、基本原理(一)化学发光反应的条件化学发光的激发能由化学反应所提供，在反应过程中，某一反应产物的分子接受反应能被激发，形成电子激发态，当它们从激发态返回基态时以辐射的形式将能量释出来。这一过程可表示为A+B─→C?+D C?─→C+?ν能够产生化学发光的反应必须具备下述条件：(1)能快速地释放出足够的能量。根据 E＝?υ计算，在可见光区观察到化学发光， 需170~300kJ·mol-1激发能。一些氧化还原反应，特别是具有过氧化物中间产物的氧化反应可满足这种要求，(2)反应途径有利于激发态产物的形成。(3)激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，或能够将其能量转移给可以产生辐射跃迁的其它分子。(二)化学发光效率和发光强度化学发光效率 φ定义为CL发射的分子数cl参加反应的分子数

r f (5-8)它等于生成激发态分子的化学效率 φr和激发态分子的发光效率φf之乘积。激发态分子发射的光子数r参加反应的分子数f激发态分子数化学效率φr主要取决于发光所依赖的化学反应本身；而发光效率φf的影响因素与荧光效率的影响因素相同。既取决于发光体本身的结构和性质，亦受环境的影响。具有最高效率的化学发光是生物体系中的化学发光，亦称生物发光(Bioluminescence)。非生物体的化学发光效率很少超过0.01。被人们认为是最有效的化学发光物质的鲁米诺反应，发光效率也仅为0.01~0.5。化学发光强度ICL与反应速率关dc有如dt下关系：ICL(t)CLdc(5-9)dt由于化学发光的强度随着时间和反应物消耗的变化逐渐减小，如果反应是一级动力学反应， t时刻的 ICL(t)与该时刻分析物浓度c成正比，即化学发光峰值强度与分析物浓度成线性关系。在化学发光分析中，常用发光总强度来进行定量分析。为此，将式(5—9)积分，得ICLdtdcCLdtdt

CL c (5—10)由式(5-10)得只，发光总强度与分析物浓度成正比，因此，根据已知时间内的发光总强度来进行化学分析的定量分析 .(三)化学发光反应的类型液相化学发光鲁米诺在碱性溶液中被H2O2、I2等氧化剂氧化，可产生最大波长为 425nm波长的光辐射。鲁米诺在碱性溶液中化学发光 .doc鲁米诺在碱性溶液中化学发光 .JPG除鲁米诺外，光泽精、没食子酸和洛粉碱等也可被氧化剂氧化产生液相化学发光。2．气相化学发光 在气相中，O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化 SO2、NO、CO等产生化学发光。例如：NO+O3―→NO?+O2?―→NO2+?vλ≥2NO2(600nm)CO+O―→CO2?CO2?―→CO2+?v(λ=300~500nm)三、化学发光分析的仪器(一)分立取样式仪器分立式化学发光分析仪是一种静态下测量液相化学发光信号的装置。基本构造如图 5—4所示。先将试剂与试样加入贮液管中，然后开启旋塞使溶液流入反应池混合，混合后化学发光反应立即发生。发光信号通过光倍增电管检测，再经放大后在记录仪上记录下来。分立式仪器具有简单、灵敏度高的待点，还可用于反应动力学的研究。但手工进样重复性差，测量的精密度不高，且难于实现自动化，分析效率也比较低。图5-04分立取样式化学发光仪器示意图.JPG图5-04分立取样式化学发光仪器示意图.doc图5-4分立取样式化学发光仪器示意图1-反应器2-反应池3-恒温水箱4-贮液管5-滤光片6-光自倍增管图5-5流动注射式化学发光仪器示意图R—试剂载流 S一试液 P一蠕动泵V—进样阀 D一化学发光检测器(二)流动注射式仪器流动注射分析是一种自动化溶液分析技术。它是把一定体积的试液(几十至几百微升)注射到一个连续流动着的载流中， 试样在流动过程中分散、反应，并被检测。流动注射式化学发光分析仪如图5—5所示。由蠕动泵、进样阀、反应盘管和化学发光检测器组成。蠕动泵的作用在于推动载流在一细孔径管道中连续稳定地流动。进样阀以重现性很高的方式把一定体积的试液注射到载流中，在流动过程中，试液逐渐分散并与载流中的试剂发生反应。在化学发光检测器中，化学发光信号被光电倍增管检测，经放大后记录下来。图5-05流动注射式化学发光仪器示意图.doc图5-05流动注射式化学发光仪器示意图.JPG由于流动注射式仪器被检测的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分，必须根据反应速率调整进样阀至检测器之间的管道长度或流速，以控制留存时间，使发光信号的峰值恰好被检测，从而获得最大灵敏度。四、化学发光分析的应用气相化学发光已广泛地应用于大气中O3、NO、NO2H2S、SO2、CO等组分的监测，目前已有各种专用的监测仪器。鲁米诺-H2O2化学发光反应能被许多过渡金属 离子所催化。利用这一性质，已建立了 Co2+、Cr3+、Cu2+、Au3+、Ag+、、2+、Mn2+、Os(III、IV、V)、Ru(IV)、Ir(IV)、Rh(V)、III)NiV(V)等金属离子的化学发光分析法，检出限均在0.01μg·mL-1以下，其中Cr3+、Co2+的检出限低于10-12g·mL-1。此外，Hg2+、Ce(IV)、Ti(IV)等金属离子和CN-、S2-等非金属离子对鲁米诺-H2O2体系的化学发光具有抑制作用， 利用抑制作用也可对这些离子进行测定。鲁米诺-H2O2体系也用于化学发光法测定许多生化物质， 如甘氨酸、铁蛋白、血红蛋白、肌红蛋白等。特别是与酶反应结合，可用于分析葡萄糖、乳酸、氨基酸等。如葡萄糖的测定：葡萄糖葡萄糖氧化酶葡萄糖H2O2H2O2+鲁米诺Fe(CN)63?v本章小节本章介绍了三种分子发光分析方法，即分子荧光、分子磷光和化学发光。1．分子荧光和分子磷光都属于光致发光。 分子激发单重态的最低级动能级向基态单重态跃迁所产生的辐射称为分子荧光。分子荧光的寿命约为 10-9~10-6。分子激发三重态的最低振动能级向基态单重态跃迁所产生的辐射称为分子磷光。分子磷光的奉命约为 10-3~10s。2．荧光分析仪器与磷光分析仪器相似，都由光源、激发单色器、液槽、发射单色器、检测器和放大显示器组成。由于在分析原理上的差别，磷光分析仪器有些特殊部件， 如试样宣室、磷光镜等。3．根据荧光强度 If和磷光强度 Ip与物质的浓度成正比进行定量分析。由于分子荧光分析法的选择性强和灵敏度高，常用于医药、食品、生物化学和天然产物的分析；分子磷光分析法主要用于生物体液中痕量药物的分析。4．化学发光是由乙学反应提供激发能， 激发产物分子或其它共存分子产生光辐射。有液相化学发光和气相化学发光两种。常用的化学发光分析仪器有分立取样式和流动注射式两种。化学发光主要应用于环境监测及生物医学分折等领域，它已成为一种重要的痕量分析方法。思考题与习题1．解释下列名词：(1)振动弛豫； (2)内转化； (3)体系间窜跃；(4)荧光激发光谱； (5)荧光发射光谱； (6)重原子效应；(7)猝灭效应。简述影响荧光效率的主要因素。试从原理和仪器两方面比较吸光光度法和荧光分析法的异同，说明为什么荧光法的检出能力优于吸光光度法。试从原理和仪器两方面比较荧光分析法、磷光分析法和化学发光分析法。如何区别荧光和磷光，其依据是什么?采取哪些措施可使磷光物质在室温下有较大的磷光效率?化学发光反应要满足哪些条件?简述流动注射式化学发光分析法及其特点。下面是古文鉴赏，不需要的朋友可以下载后编辑删除！ ！谢谢！！九歌·湘君 屈原朗诵：路英君不行兮夷犹，蹇谁留兮中洲。美要眇兮宜修，沛吾乘兮桂舟。令沅湘兮无波，使江水兮安流。望夫君兮未来，吹参差兮谁思。驾飞龙兮北征，邅吾道兮洞庭。薜荔柏兮蕙绸，荪桡兮兰旌。望涔阳兮极浦，横大江兮扬灵。扬灵兮未极，女婵媛兮为余太息。横流涕兮潺湲，隐思君兮陫侧。桂棹兮兰枻，斫冰兮积雪。采薜荔兮水中，搴芙蓉兮木末。心不同兮媒劳，恩不甚兮轻绝。石濑兮浅浅，飞龙兮翩翩。交不忠兮怨长，期不信兮告余以不闲。朝骋骛兮江皋，夕弭节兮北渚。她含着笑，切着冰屑悉索的萝卜，她含着笑，用手掏着猪吃的麦糟，她含着笑，扇着炖肉的炉子的火，她含着笑，背了团箕到广场上去晒好那些大豆和小麦，大堰河，为了生活，在她流尽了她的乳液之后，她就用抱过我的两臂，劳动了。大堰河，深爱着她的乳儿；在年节里，为了他，忙着切那冬米的糖，为了他，常悄悄地走到村边的她的家里去，为了他，走到她的身边叫一声“妈” ，大堰河，把他画的大红大绿的关云长贴在灶边的墙上，大堰河，会对她的邻居夸口赞美她的乳儿；大堰河曾做了一个不能对人说的梦：在梦里，她吃着她的乳儿的婚酒，坐在辉煌的结彩的堂上，而她的娇美的媳妇亲切的叫她“婆婆”⋯⋯⋯⋯大堰河，深爱她的乳儿！大堰河，在她的梦没有做醒的时候已死了。她死时，乳儿不在她的旁侧，她死时，平时打骂她的丈夫也为她流泪，五个儿子，个个哭得很悲，她死时，轻轻地呼着她的乳儿的名字，大堰河，已死了，她死时，乳儿不在她的旁侧。大堰河，含泪的去了！同着四十几年的人世生活的凌侮，同着数不尽的奴隶的凄苦，同着四块钱的棺材和几束稻草，同着几尺长方的埋棺材的土地，同着一手把的纸钱的灰，大堰河，她含泪的去了。这是大堰河所不知道的：她的醉酒的丈夫已死去，大儿做了土匪，第二个死在炮火的烟里，第三，第四，第五而我，我是在写着给予这不公道的世界的咒语。当我经了长长的飘泊回到故土时，在山腰里，田野上，兄弟们碰见时，是比六七年鸟次兮屋上，水周兮堂下。捐余玦兮江中，遗余佩兮澧浦。采芳洲兮杜若，将以遗兮下女。时不可兮再得，聊逍遥兮容与。注释①湘君：湘水之神，男性。一说即巡视南方时死于苍梧的舜。②君：指湘君。夷犹：迟疑不决。③蹇(jian3 简)：发语词。洲：水中陆地。④要眇(miao3秒)：美好的样子。宜修：恰到好处的修饰。⑤沛：水大而急。桂舟：桂木制成的船。⑥沅湘：沅水和湘水，都在湖南。无波：不起波浪。⑦夫：语助词。⑧参差：高低错落不齐，此指排箫，相传为舜所造。⑨飞龙：雕有龙形的船只。北征：北行。⑩邅(zhan1沾)：转变。洞庭：洞庭湖。⑾薜荔：蔓生香草。柏 (bo2伯)：通“箔”，帘子。蕙：香草名。绸：帷帐。⑿荪：香草，即石菖蒲。桡 (rao2 饶)：短桨。兰：兰草：旌：旗杆顶上的饰物。⒀涔(cen2岑)阳：在涔水北岸，洞庭湖西北。极浦：遥远的水边。⒁横：横渡。扬灵：显扬精诚。一说即扬舲，扬帆前进。⒂极：至，到达。⒂女：侍女。婵媛：眷念多情的样子。⒃横：横溢。潺湲 (yuan2援)：缓慢流动的样子。⒅陫(pei2 培)侧：即“悱恻”，内心悲痛的样子。櫂(zhao4棹)：同“棹”，长桨。枻(yi4弈)：短桨。斲(zhuo2琢)：砍。搴(qian1千)：拔取。芙蓉：荷花。木末：树梢。媒：媒人。劳：徒劳。甚：深厚。轻绝：轻易断绝。石濑：石上急流。浅(jian1间)浅：水流湍急的样子。翩翩：轻盈快疾的样子。交：交往。期：相约。不闲：没有空闲。鼂(zhao1招)：同“朝”，早晨。骋骛(wu4务)：急行。皋：水旁高地。弭(mi3米)：停止。节：策，马鞭。渚：水边。次：止息。(31)周：周流。捐：抛弃。玦(jue1决)：环形玉佩。遗(yi2仪)：留下。佩：佩饰。醴(li3里)：澧水，在湖南，流入洞庭湖。芳洲：水中的芳草地。杜若：香草名。遗(wei4味)：赠予。下女：指身边侍女。聊：暂且。容与：舒缓放松的样子。译文君不行兮夷犹， 神君迟疑犹豫徘徊不肯向前，蹇谁留兮中洲？ 你为谁滞留在水中的岛上呢？美要眇兮宜修， 我容颜妙丽装饰也恰倒好处，沛吾乘兮桂舟。 急速地乘坐上我那桂木小舟。令沅、湘兮无波， 叫沅湘之水柔媚得波澜不生，使江水兮安流。 让长江之水平静地缓缓前行。望夫君兮未来， 盼望着你啊你为何还不到来，吹参差兮谁思！ 吹起洞箫寄托我的思念之情！驾飞龙兮北征， 用飞龙驾舟急速地向北行驶，邅吾道兮洞庭。 改变我的道路引舟直达洞庭。薜荔柏兮蕙绸， 用薜荔做门帘用蕙草做床帐，荪桡兮兰旌。 以香荪装饰船桨以兰草为旗。望涔阳兮极浦， 遥望涔阳啊在那辽远的水边，横大江兮扬灵。 大江横陈面前彰显你的威灵。扬灵兮未极， 难道你的威灵彰显还没终止？女婵媛兮为余太息！ 我心中为你发出长长的叹息。横流涕兮潺湲， 眼中的清泪似小溪潺潺流下，隐思君兮陫侧。 暗地里思念你心中充满悲伤。桂棹兮兰枻， 想用桂木作成桨兰木作成舵，斫冰兮积雪。 劈开你坚冰积雪也似的情怀。采薜荔兮水中， 却似在水中采集陆生的薜荔，搴芙蓉兮木末。 更似爬树梢采摘水生的芙蓉。心不同兮媒劳， 两心不相通让媒妁徒劳无功，恩不甚兮轻绝。 恩爱不深切就会轻易的断绝。石濑兮浅浅， 留连着沙石滩上浅浅的流水，飞龙兮翩翩。 等待着你驾着飞龙翩然降临。交不忠兮怨长， 你交情不忠徒增我多少幽怨，期不信兮告余以不间。 既相约又失信却说没有时间。朝骋骛兮江皋， 早晨我驾车在江边急急奔驰，夕弭节兮北渚。 晚间我停鞭在北岸滩头休息。鸟次兮屋上， 众鸟栖息在这空闲的屋顶上，水周兮堂下。 空屋的四周有流水迂缓围绕。捐余玦兮江中， 将你赠的玉制扳指置于江中，遗余佩兮澧浦。 将你赠的玉佩放在澧水岸边。采芳洲兮杜若， 采来香草装饰这芬芳的洲渎，将以遗兮下女。 这一切都是你留给我的信物。时不可兮再得， 难道那往昔的时光不可再得，聊逍遥兮容与。 暂且慢步洲头排除心中烦恼。赏析在屈原根据楚地民间祭神曲创作的《九歌》中，《湘君》和《湘夫人》是两首最富生活情趣和浪漫色彩的作品。人们在欣赏和赞叹它们独特的南国风情和动人的艺术魅力时，却对湘君和湘夫人的实际身份迷惑不解，进行了长时间的探讨、争论。从有关的先秦古籍来看，尽管《楚辞》的《远游》篇中提到“二女”和“湘灵” ，《山海经·中山经》中说“洞庭之山⋯⋯帝之二女居之，是常游于江渊”，但都没有像后来的注释把湘君指为南巡道死的舜、把湘夫人说成追赶他而溺死湘水的二妃娥皇和女英的迹象。最初把两者结合在一起的是《史记·秦始皇本纪》 。书中记载秦始皇巡游至湘山 (即今洞庭湖君山)时，“上问博士曰:‘湘君何神？’博士对曰:‘闻之，尧女，舜之妻，而葬此。’”后来刘向的《列女传》也说舜“二妃死于江、湘之间，俗谓之湘君” 。这就明确指出湘君就是舜的两个妃子， 但未涉及湘夫人。 到了东汉王逸为《楚辞》作注时，鉴于二妃是女性，只适合于湘夫人，于是便把湘君另指为“湘水之神” 。对于这种解释。唐代韩愈并不满意，他在《黄陵庙碑》中认为湘君是娥皇，因为是正妃故得称“君”；女英是次妃，因称“夫人”。以后宋代洪兴祖《楚辞补注》、朱熹《楚辞集注》皆从其说。这一说法的优点在于把湘君和湘夫人分属两人，虽避免了以湘夫人兼指二妃的麻烦，但仍没有解决两人的性别差异，从而为诠释作品中显而易见的男女相恋之情留下了困难。有鉴于此，明末清初的王夫之在《楚辞通释》中采取了比较通脱的说法，即把湘君说成是湘水之神，把湘夫人说成是他的配偶，而不再拘泥于按舜与二妃的传说一一指实。应该说这样的理解，比较符合作品的实际，因而也比较可取。虽然舜和二妃的传说给探求湘君和湘夫人的本事带来了不少难以自圆的穿凿附会，但是如果把这一传说在屈原创作《九歌》时已广为流传、传说与创作的地域完全吻合、《湘夫人》中又有“帝子”的字样很容易使人联想到尧之二女等等因素考虑在内，则传说的某些因子如舜与二妃飘泊山川、会合无由等，为作品所借鉴和吸取也并不是没有可能的。因此既注意到传说对作品可能产生的影响，又不拘泥于传说的具体人事，应该成为我们理解和欣赏这两篇作品的基点。由此出发，不难看出作为祭神歌曲，《湘君》和《湘夫人》是一个前后相连的整体，甚至可以看作同一乐章的两个部分。这不仅是因为两篇作品都以“北渚”相同的地点暗中衔接，而且还由于它们的末段，内容和语意几乎完全相同，以至被认为是祭祀时歌咏者的合唱(见姜亮夫《屈原赋校注》)。这首《湘君》由女神的扮演者演唱，表达了因男神未能如约前来而产生的失望、怀疑、哀伤、埋怨的复杂感情。第一段写美丽的湘夫人在作了一番精心的打扮后，乘着小船兴致勃勃地来到与湘君约会的地点，可是却不见湘君前来，于是在失望中抑郁地吹起了哀怨的排箫。首二句以问句出之，一上来就用心中的怀疑揭出爱而不见的事实，为整首歌的抒情作了明确的铺垫。以下二句说为了这次约会，她曾进行了认真的准备，把本已姣好的姿容修饰得恰到好处，然后才驾舟而来。这说明她十分看重这个见面的机会，内心对湘君充满了爱恋。正是在这种心理的支配下，她甚至虔诚地祈祷沅湘的江水风平浪静，能使湘君顺利赴约。然而久望之下，仍不见他到来，便只能吹起声声幽咽的排箫，来倾吐对湘君的无限思念。这一段的描述，让人看到了一幅望断秋水的佳人图。第二段接写湘君久等不至，湘夫人便驾着轻舟向北往洞庭湖去寻找，忙碌地奔波在湖中江岸，结果依然不见湘君的踪影。作品在这里把对湘夫人四出寻找的行程和她的内心感受紧密地结合在一起。你看她先是驾着龙舟北出湘浦，转道洞庭，这时她显然对找到湘君满怀希望；可是除了眼前浩渺的湖水和装饰精美的小船外，一无所见；她失望之余仍不甘心，于是放眼远眺涔阳，企盼能捕捉到湘君的行踪；然而这一切都毫无结果，她的心灵便再次横越大江，遍寻沅湘一带的广大水域，最终还是没有找到。如此深情的企盼和如此执着的追求，使得身边的侍女也为她叹息起来。正是旁人的这种叹息，深深地触动和刺激了湘夫人，把翻滚在她内心的感情波澜一下子推向了汹涌澎湃的高潮， 使她止不住泪水纵横，一想起湘君的失约就心中阵阵作痛。第三段主要是失望至极的怨恨之情的直接宣泄。首二句写湘夫人经多方努力不见湘君之后，仍漫无目的地泛舟水中，那如划开冰雪的船桨虽然还在摆动，但给人的感觉只是她行动的迟缓沉重和机械重复。接着用在水中摘采薜荔和树上收取芙蓉的比喻，既总结以上追求不过是一种徒劳而已，同时也为后面对湘君“心不同” 、“恩不甚”、“交不忠”、“期不信”的一连串斥责和埋怨起兴。这是湘夫人在极度