药品分析方法建立及验证-从质量控制出发

药品分析方法建立及验证——从质量控制出发2016.03.23健康元生物医药有限公司目录

方法开发考虑方法哪里来开发什么方法

检测方法初识

分析方法验证分析方法确认及再验证方法考虑虑原则预期的监监督机构构期望产品质量量参数对对安全性性和有效效性的预预期影响响分子的具具体开发发经验来自之前前以开发发的类似似分子的的平台经经验方法开发发考虑折叠结构构可以防防止生物物制品降降解，但但同时使使分子的的某些部部分难以以被检测测到被结构所所保护的的易受影影响基团团延缓了了降解过过程（氧氧化、脱脱酰胺基基、切断断和聚合合）完整结构构使得分分析方法法很难检检测到内内部的变变化在某些分分析中保保持三维维结构是是很重要要的（如如SEC），但在在其他一一些分析析中则需需拆开折折叠结构构（如变变性凝胶胶电泳））方法开发发考虑如何解释释不是针针对完整整分子而而是针对对裂解部部分所进进行的检检测而获获得的数数据有时有必必要将一一个蛋白白分子裂裂解为所所需的片片段，然然后对所所关注的的片段进进行分析析，如用用于蛋氨氨酸氧化化测定肽肽图多数时候候片段并并非以简简单直接接或线性性的方式式与完整整分子相相关联（（不再是是1：1）需要明确确地确定定完整分分子的片片段进行行分析而而得到的的某些参参数的报报告值方法开发发考虑从不同正正交试验验或从主主要和辅辅助试验验所得的的杂质量量并不是是可以累累加的生物制品品需要多多项检测测来检量量其多种种特性，，如电荷荷、分子子大小等等如果一个个分子包包含多种种修饰，，则它将将被多次次计算，，但是降降解的分分子仍然然只有一一个所以不同同检测所所得到的的值是不不能累加加的方法开发发考虑对于所要要分析的的蛋白质质物种，，通常无无法获得得纯的样样品用来进行行加样/回收的物物质是所所要分析析的蛋白白质物种种（杂质质）的富富集物，，而不是是纯化物物很多时候候，峰并并不能达达到基线线分离可容许实实验误差差较大定量限较较高方法开发发考虑基质（配配方组成成）或酸酸碱度变变化、自自由巯基基的出现现等，可可能在分分析过程程中形成成原来并并不存在在的杂质质通过溶液液交换消消除基质质影响减少暴露露于过高高或过低低酸碱度度溶液的的时间在某些特特定方法法中，自自由巯基基会导致致分析方方法造成成的杂质质这些都是是要设法法避免方法开发发考虑1.生物学活活性：是是反映生生物技术术药物质质量的重重要指标标，通常常使用细细胞或动动物进行行测定，，误差相相对较大大。不同同批细胞胞、血清清、或其其它易变变性物质质对测定定方法的的准确度度和精密密性均有有影响。。2.生物技术术药物多多为生物物大分子子药物，，具有分分子量大大、结构构多样性和和可变性等等特点，，结构的的细微变变化可影影响药物物的活性性和质量量。3.对酸、碱碱、高温温、冻融融等不稳稳定，保保存、运运输条件件不当会会影响药品质量，并并可能导导致方法法转移困困难或失失败。4.标准物质质：活性性标准品品、含量量标准品品、理化化对照品品，根据据情况可能分别制备备，保存存、运输输条件相相对较高高，需对对其稳定定性进行行认真分析析与评价。。方法哪里里来标准方法法（或正正式方法法、法定定方法））一般是指指已有国国家标准准的质控控方法，，WHO推荐的质质控方法法也可作作为重要要参考。。此类方方法在被被确定为为标准方方法前已已经过了了适当的的验证。。申报者者应说明明方法的的来源，，并附具具体方法法。研制制单位在在首次采采用此类类方法前前，也应应对该方方法进行行适当的的验证，，如进行行专属性性和精密密度的验验证，以以便证明明在实际际的使用用条件下下该方法法也是适适用的。。标准方法法的替代代方法此类方法法系指由由申报者者提出的的可取代代标准方方法的替替代方法法。申报报者在决决定采用用此类方方法时应应持慎重重的态度度，并需需提供表表明新方方法等同同于或优优于原方方法的依依据以及及全面的的验证资资料，包包括两种种方法的的比较性性资料。。来自参考考文献的的方法是指在专专业杂志志或著作作上发表表并介绍绍的方法法，一般般要认真真对待此此类方法法，并需需进行全全面的验验证。应应说明参参考文献献的出处处，附原原文及译译文。自己建立立的方法法对于某些些产品，，尤其是是创新性性产品来来讲，由由于缺少少可参考考的方法法，通常常需要自自己建立立一种新新的分析析方法，，对于这这类方法法需进行行全面而而严格的的验证。。开发什么么方法适用于所所有分子子的方法法蛋白浓度度或含量量紫外/可见光光光度法（（基于消消光系数数，灵敏敏度低，，干扰物物多）高效液相相色谱法法（基于于标准样样校正））BCA//TCA/G250（基于标标准样校正，基基质有可能干扰扰)电荷概括括离子交换换色谱（（原始状状态）毛细管等等电聚焦焦法（原原始状态态和局部部变性状状态）开发什么么方法适用于所所有分子子的方法法分子大小小概况SEC（原始状状态）凝胶电泳泳法（非非折叠（（变性））状态））病毒样颗颗粒概况况电镜（局局部原始始状态，人人为影响响因素大大）DLS（原始状态，分分辨率差差，大小小精准））SEC（原始状状态，流流动相会会影响蛋蛋白状态态）开发什么么方法适用于所所有分子子的方法法杂质残留留量HPLC（基于标标准样校校正或自自身对照照）GC（对残留留溶剂））ICP//AAS（对元素素测定））Elisa（宿主蛋蛋白、杂杂蛋白测测定）SouthernBlot/荧光光谱谱（残残留DNA）开发什么么方法适用于特特定分子子的方法法分子鉴定定肽图（（纯度较较高）WesternBlot（使用范范围广））紫外扫描描图（（纯度及及基质要要求高））氨基酸测测序(纯度及基基质要求求高，样样品末端端无封闭闭）偶联密度度ADC（抗体药药物偶联联物）抗原与载载体蛋白白偶联物物（疫苗苗类药物物）结合力抗原与佐佐剂相互互作用开发什么么方法适用于特特定分子子的方法法活性测定定Elisa（体外评评价）动物实验验（体体内评价价）中和实验验（细细胞测定定特定表表位）降解物测测定HPLC/MS（基于标准准样校正正或自身身对照）凝胶电泳泳（基基于特异异分子带带）SEC//荧光光谱谱（解解聚或聚聚合）开发什么么方法检测方法法初识——电泳及毛毛细管电电泳检测方法法初识——SEC检测方法法初识——DAD光谱检测方法法初识——荧光光谱谱检测方法法初识——HPLC肽图检测方法法初识——UVCp-Temp检测方法法初识——HPLC肽图睫状神经经营养因因子(ciliaryneurotrophicfactor,,CNTF)检测方法法初识——ESI-MS分析方法法验证——法规要求求资料6.质量研究究资料，，临床前前有效性性及安全全性研究究资料（1）质量研研究及注注册标准准研究资资料；（2）检定方方法的研研究以及及验证资资料；（3）与同类类制品比比较研究究资料；；（4）产品抗抗原性、、免疫原原性和动动物试验验保护性性的分析析资料；；（5）动物过过敏试验验研究资资料；（6）动物安安全性评评价资料料。分析方法法验证——法规要求求1.6探索性研究及其其检验结结果分析析1.6..1开展探索索性研究究项目及及其目的的。叙述述开展探探索性研研究的项项目，研研究目的的，采用用的主要要方法。。1.6..2探索性研研究及其其检验结结果分析析。逐项项叙述探探索性研研究项目目详细研研究方法法，样品品与对照照品的典典型图谱谱或照片片，研究究结果与与结论。。该项目的的方法学学按中国国药典附附录验证证，详细细方法学学验证内内容在附附件中列列出。分析方法法验证——法规要求求分析方法法验证——法规要求求分析方法法验证——法规要求求第十二条条质量量控制的的基本要要求：（四）检检验方法法应当经经过验证证或确认认；第二百二二十三条条物料料和不同同生产阶阶段产品品的检验验应当至至少符合合以下要要求：（二）符符合下列列情形之之一的，，应当对对检验方方法进行行验证：：1.采用新的的检验方方法；2.检验方法法需变更更的；3.采用《中华人民民共和国国药典》及其他法法定标准准未收载载的检验验方法；；4.法规规定定的其他他需要验验证的检检验方法法。（三）对对不需要要进行验验证的检检验方法法，企业业应当对对检验方方法进行行确认，，以确保保检验数数据准确确、可靠靠；分析方法法验证——验证项目目验证项目ChP鉴别试验杂质定量杂质限度活性测定含量测定准确性-+-++精密度-+-++耐用性+++++线性-+-++范围-+-++专属性+++++检测限--+--定量限-+----不强制要求+必须进行限度、鉴鉴定等定定性或半半定量试试验，无无标准曲曲线，不不作精密密度、准准确度要要求。分析方法法验证——验证项目目验证项目USPI类II类III类IV类定量限度检查准确度++**-精密度++-+-专属性+++*+检测限--+*-定量限-+-*-线性++-*-范围++**--不强制要求+必须进行*根据不同的方法特点也可能需要I类方法：：制剂中中原料药药或活性性成分（（包括防防腐剂））的定量量分析方方法；II类方法：：原料药药中杂质质或制剂剂中降解解化合物物的分析析方法；；包括定定量方法法和限度度检查；；III类方法：：药物性性能特征征分析方方法：溶溶出，药药物释放放IV类方法：：鉴别实实验分析方法法验证——验证项目目参数（parameler)机构（organization）专属性/特异性（specificity）USP,EP,ChP,ICH选择性（selectivity）ISO17025精密度（precision）USP,EP,ChP,ICH重复性（repeatability）ICH,ChP,ISO17025中间精密度（intermediateprecision）ICH,ChP重现性（reproducibility）USP,ChP,ICH,ISO17025准确度（accuracy）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025线性（linearity）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025范围（range）USP,ChP,ICH检测限（detectionlimit）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025定量限（quantitationlimit）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025耐用性（robustness）USP,EP,ChP,ISO17025定义：指一种种方法在在有可能能的干扰扰物质（（如杂质、降降解产物和基基质）存存在时，，能够准准确无误误地评估被分析物的的能力分析方法法验证——专属性鉴别:确保可以以鉴别被被分析物物纯度检查查：确保保所有的的分析过过程能够够为杂质质的含量量提供准准确的数数据，如如相关物物质检查查、重金金属限度度检查、、有机挥挥发性杂杂质检查查等含量测定定：提供供准确的的检测结结果以保保证含量量样品中中被分析析物的含含量或效效价值准准确无误误在其他成成分（杂杂质、降降解产物物、辅料料等）存存在下，，采用的的分析方方法能够够正确测测定被测测物的能能力。作作为分析析方法的的成立基础础。一般采用用相似物物、不含含API空白样品品作为阴阴性对照照，以标标准品或或经认可可样品作作为阳性性对照。。如采用免免疫印迹迹试验进进行生物物制品的的鉴别，，应首先先对所使使用抗体体的特异异性进行行分析；；若供试试品中还还存在其其它组分分，则应应进一步步验证被被检测物物中其它它物质能能否引起起非特异异性免疫疫反应。。例如：如采用细胞胞测定方方法检测测生物活活性，应应首先说说明被测测物质与与特定的的细胞应应答之间间的相关关性，如如二者的的相关性性较好，，则一般般认为该该方法的的特异性性较好。。为表明明细胞测测定方法法的特异异性，可可进行相相关试验验进行验验证，如如加入抗抗体或特特异抑制制剂的封封闭实验验等。如如果成品品中加入入了可能能影响活活性测定定的辅料料，应进进行相关关验证以以排除此此种影响响。如采用ELISA法检测重重组产品品的残余余宿主蛋蛋白含量量，可采采用与表表达体系系相同的的宿主细细胞的蛋蛋白作为为免疫原原制备抗抗体，若若采用与与产品相相似工艺艺进行处处理后再再免疫动动物，则则所获得得抗体的的特异性性更好。。另外，，产品中中存在的的大量目目的蛋白白可能影影响残余余宿主蛋蛋白的测测定，应应进行相相关验证证以排除除此种影影响。分析方法法验证——专属性定性分析析（鉴别别）：样样品阳性性结果＋＋空白阴阴性结果果＋结构构相似物物质的阴阴性结果果；分析方法法验证——专属性杂质检查查（对照照品可得得）：将将可能的的杂质对对照品加加入样品品中；杂质检查查（对照照品不可可得）：：用另外一一种官方方的标准准或经验验证的方方法对样样品和经经降解的的样品分分析，比比较两种种方法得得到的杂杂质概况况使用其他他技术对对峰纯度度进行检检查，如如二极管管阵列检检测器、、MS等含量测定定：被分分析物与与其他干干扰峰完完成分离离。向样样品中加加入一定定量的干干扰物，，含量测测定的结结果不受受干扰；；检查主主峰的纯纯度鉴别：采采用与被被测物结结构类似似的化合合物以及及被测物物分别进进行鉴别别试验。。被测物物为正反反应。被被测物结结构类似似的化合合物为负负反应。。测物结结构类似似的化合合物可选选用中间间体、副副产物或或降解产产物等。。定义：对对均一样样品重复复取样检检测每个个检测结结果间的的接近程程度，RSD%%,CV%分析方法法验证——精密度重复性repeatability：短时间间内同一一分析人人员使用用同一仪仪器中间精密密度intermediateprecision:在同一实实验室内内的变化化，如不不同分析析时间、、不同分分析人员员、不同同分析仪仪器重现性reproducibility::在不同实实验室内内重复方法100％浓度≥≥6次3浓度×3次定义：方法的的检测结结果与真真实值的的接近程程度。分析方法法验证——准确度－方法：：原料药：分析已已知含量量的对照照品；第第二种确定的方法分析析，结果果比较制剂：加样回回收；第第二种确确定的方方法分析析，结果比较应在方法法的范围围内计算回收收率：3浓度×3次分析方法法验证——精密度与与准确度度定义：在在声明的的实验条条件下所所能检测测到的被被分析物物的最小小量。限限度检查查的指标标；表示示为在样样品中的的浓度％％,ppm分析方法法验证——检测限方法：检测已知浓度度的样品品(对照品)杂质的DL<0.05%信噪比2:1//3:1分析方法法验证——定量限定义：在在声明的的实验条条件下被被分析物物可被定定量分析析并能满满足合格格的精密密度和准准确度的的最小值值。微量量物质的的定量分分析：有有关物质质定量分分析，有有机挥发发性物质质的定量量分析。。％，ppm方法：已知浓度度样品（（对照品品）相关物质<0.05％证明精密度和和准确度度信噪比10:1分析方法法验证——标准曲线线及线性性范围标准曲线线：一定定浓度范围围内，仪仪器对分分析物的的响应，，可通过过一定浓浓度的分分析物（（或内标标物）与与被分析析物比较较，计算算其含量量。基质应尽尽可能保保持与样样品一致致，但不不应参与与样品前前处理工工序。因为样样品前处处理工序序中，可可能有不不同程度度的损失失。若在任何何转换后后均不能能证明呈呈线性，，或呈线线性关系系的范围围较小，，可以采采用曲线线拟合方方法，通通过测定定全范围围曲线，，在标准准品或参参考品的的矫正下下，依ED50或IC50值计算活活性单位位。应提提供拟合合曲线方方程及各各参数，，并提供供相关系系数。线性范围围：在适当的的精密度度、准确确度和线线性基础上检测到到的被分分析物的的最低水水平到最最高水平区间间分析方法法验证——标准曲线线及线性性范围一定范围围内的不不同浓度度点进样样，绘制制响应值值（y）与浓度度(x)之间的回回归线，，计算回回归方程程，相关关系数（（r,r2）主成分含含量测定定：80％－120％检测浓浓度杂质含量量测定：：定量限限（50％）－120％标准装量差异异：70％－130％检测值值溶出实验验：±20％规定范范围分析方法法验证——标准曲线线样品吸收收值为：：1.314测定值为为：869..3μg/ml若标准曲曲线处理理后，出出现2%的损耗，，则测定值为为：910..6μg/ml测定值为为：4.75%分析方法法验证——耐用性定义：分分析方法法的某些些参数发发生微小小变化时时方法抗抗干扰的的能力，，表示在在正常使使用时的的可靠性方法：刻意改改变参数数，考察察结果的的变化流动相的pH值、流动动相的组组成（极极性的变变化）、、不同供应商柱柱子、柱柱温、流流速等液相：评评估柱温温、流速速、色谱谱柱、缓缓冲盐pH、有机相相比例、、流动相相比例、、溶液放放置时间间对检测测结果的的影响气相：评评估柱温温、流速速、色谱谱柱、溶溶液放置置时间对对检测结结果的影影响分析方法法验证——SEC基本要求求确定无标准品品，假设设单体、、聚合物物或VLP在214nm/280nm响应因子子基本相相同，以以峰面积积百分比比代表重重量百分分比有标准品品，进标标准品，，测定各各自响应应因子，，以校正正峰面积积百分比比代表重重量百分分比对于蛋白白样品而而言，214nm肽键特异异波长段段响应值值高，280nm为蛋白特特异波长长段响应应值低。。通常以以280nm作为检测测波长。。要求能够够对样品品不同聚聚集、结结合状态态进行分分离。分析方法法验证——SEC系统精密密度将加入了5%聚合物的的单个样样品连续续进样6次，计算算6次进样的的聚合物峰面积的的相对标标准偏差差(RSD)值方法精密密度和中中间精密密度使用分别别由两位位分析人人员制备备的加入入了浓度度为2.5%%、5.0%%和7.5%%聚合物的的各三份份重复样样品(总共18份配制液液)方法精密密度是三三份重复复样品的的最大相相对标准准偏差(RSD)值中间精密密度是所所有样品品的相对对标准偏偏差(RSD)值分析方法法验证——SEC线性及范范围使用1.0%%、2.5%%、3.7%%、5.0%%、6.3%%、7.5%%和9.0%%聚合物的的样品计算聚合物%与聚合物物峰面积积的线性性回归准确度使用1.0%%、2.5%%、3.7%%、5.0%%、6.3%%、7.5%%和9.0%%聚合物的的样品根据高纯度单单体样品品中的单单体和聚聚合物含含量、聚聚合物富富集样品品中的单体和聚聚合物含含量以及及加样中中所用的的体积来来计算加加样样品品中的理论预期聚合合物含量量分析方法法验证——SEC红线：药药源；蓝蓝线：：空白；；黑线：：稀释释液专属性分析方法法验证——SEC验证数据据验证参数验收标准精密度系统精密度RSD≤3%方法精密度RSD≤3%中间精密度RSD≤5%专属性单体、聚合物色谱峰充分分离，空白和稀释液不干扰色谱峰线性R>0.99范围2.5%-7.5%准确度85%~115%定量限≤2.5%耐用性流动相pH±0.5、缓冲盐±5%内、同填料同厂家色谱柱，色谱分离无异常分析方法法验证——报告部分分第二百二二十三条条物料和不不同生产产阶段产产品的检检验应当当至少符符合以下下要求（六）检检验记录录应当至至少包括括以下内内容1.产品或物物料的名名称、剂剂型、规规格、批批号或供供货批号号，必要要时注明明供应商商和生产产商（如如不同））的名称称或来源源；2.依据的质质量标准准和检验验操作规规程；3.检验所用用的仪器器或设备备的型号号和编号号；4.检验所用用的试液液和培养养基的配配制批号号、对照照品或标标准品的的来源和和批号；；5.检验所用用动物的的相关信信息；6.检验过程程，包括括对照品品溶液的的配制、、各项具具体的检检验操作作、必要要的环境境温湿度度；7.检验结果果，包括括观察情情况、计计算和图图谱或曲曲线图，，以及依依据的检检验报告告编号；；8.检验日期期；9.检验人员员的签名名和日期期；10.检验、计计算复核核人员的的签名和和日期。。（七）所所有中间间控制（（包括生生产人员员所进行行的中间间控制）），均应应当按照照经质量量管理部部门批准准的方法法进行，，检验应应当有记记录；（八）应应当对实实验室容容量分析析用玻璃璃仪器、、试剂、、试液、、对照品品以及培培养基进进行质量量检查；；分析方法法确认——适用范围围适用于药药典方法法和其他他已验证证的法定定标准。。因为药药典方法法和其他他法定标标准被认认为是验验证过的的分析方方法，不不需要验验证，但但需要通通过方法法确认来来证明方方法在该该实验室室条件下下的适应应性。分析方法法确认