技术与质谱仪的使用

关于技术与质谱仪的使用第1页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四MALDI技术离子化技术：MALDIMatrix-AssistedLaserDesorption/IonizationMALDI技术的原理样品与基质，在样品靶表面形成的共结晶薄膜激光照射，基质吸收能量基质把能量传递给样品分子，将电荷转移给样品，样品电离。第2页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四MALDI技术中基质的作用基质的作用把样品分子彼此分开(基质：样品=10，000：1)，削弱样品分子之间的相互作用。基质吸收激光的能量，并将部分能量传递给样品。帮助样品离子化。第3页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四常用基质及选择基质样品HCCA蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物DHB蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物HPA核苷酸Dithranol非极性聚合物IAA非极性聚合物第4页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四LaserSampleTargetDetectorClockTime-of-FlightMolecularMassTOF的基本原理

第5页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四EnablingLifeScienceToolsBasedonMassSpectrometryTMEk

=zqUEk=1/2mV2V2=2qUz/m=2qU/(m/z)第6页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四triggerdiodelaservariableattenuator250l/sturbo250l/sturbo3.4mreflector1.8mlinearMALDITOFMS的构成检测器1：线性模式检测器2：反射模式第7页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四反射模式下TOF的分辨率高于线性模式第8页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四线性模式和反射模式优缺点所选方法（即flexcontrolmethods）反射模式（linear）一般测试分子量小于4000的样品分辨率高，单同位素清晰准确线性模式（reflection）一般测试大分子量样品（M>4000）分辨率低，得到是平均分子量的质荷比第9页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四样品和标准品点靶标准品的作用：对仪器参数进行校准，使样品测试的质量准确度更高。注意：样品和标准品，必须点靶方式一致，所选基质一样。第10页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四内标法和外标法内标法:样品与标准品点在同一靶点。优点：样品和标准点条件一致，质量准确度更高，质荷比可准确到0.02。缺点：标准品干扰样品出峰。外标法:样品与标准品点在不同靶点。优点：无标准品干扰缺点：质量准确度低，质荷比准确到0.1。第11页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四MALDI常用点靶方法干滴法（DriedDroplet）样品和基质充分混合，点样样品靶上。注意：以HCCA和DHB为基质的样品，一般用干滴法点靶薄层法先将基质点于靶上，带基质结晶后，再把样品溶液点于基质的层上。注意：以HPA为基质的样品，都要采用薄层法。第12页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四点样方法：DriedDropletmatrixanalytesamplesolutionsampledepositionAnalytedispersedthroughoutmatrixcrystalsEnablingLifeScienceToolsBasedonMassSpectrometryTM第13页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四MALDI-TOF质谱仪的使用标准品点靶；样品点靶；进样品靶；质谱测试和图谱保存：flexcontrol软件；图谱读取和分析：flexanalysis软件第14页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四点靶注意事项移液枪的使用取不同试剂，需要更换一次性枪头。点靶注意事项防止基质污染，防止标准品污染，防止样品靶污染，防止试剂污染防止样品靶跌落点靶时，枪头请勿接触样品靶（悬点）点完靶，请在靶表相应位置标明样品名第15页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四进靶和退靶点击仪器右侧面的绿色按钮（loadandeject按钮）。在flexControl软件里，点击carrier后面按钮进退靶按钮第16页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四质谱测试和图谱保存质谱测试的软件是：flexcontrol打开软件选择方法校准仪器的参数（与ESI-MS（LCQ）差别）扫描样品保存数据上传数据至大型仪器管理平台文件系统第17页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四打开桌面Flexcontrol软件双击打开flexcontrol第18页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四选择方法选择方法第19页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四方法的选择根据分子量大小选择相应的方法方法路径：D:\methods\flexcontrolmethods\usualmethod一般样品正离子都能出峰；对于正离子模式不出峰的样品，改换为负离子模式的方法扫描。更换方法时，对以前的方法不要保存。第20页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四选择方法L:线性模式R:反射模式P:正离子模式N:负离子模式PepMix:多肽混合物，适合范围700-4000DaProtMix:蛋白混合物，适合范围5000–20000DaClinProt:多肽/蛋白化合物，适合范围1000–20000Da66kDa:大分子蛋白，适合范围20000-100000DaProteomics_HPC:高精度校正，适合范围700-4000DaRP_lowmolecular_HPC高精度校准，适合范围100-1000Da第21页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四2.反射模式；正离子；高精度；700-4000Da；与RP_PepMix.par差别不大1.反射模式；正离子；700-4000Da3.线性模式；正离子；700-4000Da4.反射模式；负离子；700-4000Da5.线性模式；正离子；5000-20000Da6.线性模式；负离子；700-4000Da7.反射模式；正离子；100-1000第22页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四Flexcontrol的按钮检测范围，可微调扫描区放大表峰显示单次扫描显示叠加图第23页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四保存数据的按钮第24页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四校准仪器的参数第25页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四扫描标准品时，出峰太弱，多叠加几次。点击Calibrate，选中叠加图，点击自动校准（automaticassign），点击apply，即完成自动校正。如果自动校准通过不了，进行手动校准。注意：必须有三个以上的点匹配上，匹配点越多越好第26页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四手动校准第27页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四扫描样品和保存数据找到样品点的位置扫描样品，叠加并保存数据

注意：数据要保存到课题文件夹内，例如：刘育课题组数据保存到D:\data\Liuyu\2011\06第28页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四在flexAnalysis打开保存的路径样品的名字保存的是叠加图FlexAnalysis方法，可不选择第29页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四数据的上传找到所保存的数据文件右键点击发送到压缩文件夹（zipped）打开大型仪器管理系统网站（）文件系统，上传压缩后的数据文件夹。第30页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四第31页，共34页，2022年，5月20日，21点40分，星期四MALDI质谱图解析常见离子峰：正电荷模式：加质子峰；加合碱金属峰（加Na+峰；加K+峰）;减e-峰负电荷模式：加e-峰，加Cl-多出现单电荷分子离子峰，双电荷和多电荷峰弱或几乎不出现。第32页，共34页，202