植物组织培养技术第三章第四章植物器官的培养课件

第三章培养物的脱分化与再分化

理论基础：1、植物细胞的全能性：2、植物细胞的全能性应用：用人为的方法创造出一个适合于生长发育的理想条件（无菌条件、碳源、无机营养、有机营养、植物生长调节剂、ph、温度光照等），使细胞的全能性得到充分发挥。一般情况处于无菌条件，靠人工的营养及激素条件进行代谢，使细胞处于异样状态，一个分生组织可通过三个途径实现细胞的全能性。1）由分生组织直接分生芽而达到快速繁殖的目的，这种情况极少发生细胞无性变异；2）由分生组织形成愈伤组织，经过分化实现细胞全能性；3）游离细胞或原生质体形成胚状体，又胚状体直接重建完整植株。2022/10/181制作者：吴翠云在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织的形成和形态的发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。因此，脱分化、再分化是植物组织培养中必不可少的两个基本过程。脱分化：指已分化的外植体细胞（组织、器官），在切割损伤和培养物内外因素的共同作用下，逐渐丧失其原有的分化结构和功能，最后形成细胞团或愈伤组织的过程。再分化则是指离体培养物由脱分化状态再度分化的过程。2022/10/182制作者：吴翠云3、外植体的脱分化：外植体细胞应激于损伤和离体培养而出现的脱分化，使培养物细胞在结构上可见到的第一个变化。脱分化的细胞在一定条件下可进行不断分裂和生长，也可不经分裂而直接在分化为其他类型的细胞或胚状体。与脱分化有关的因子及其作用：1）损伤刺激，损伤首先导致外植体产生生化反应，其次导致呼吸活性的变化，还会导致很多酶活性的增加。2）培养细胞的异质性，异质性细胞对培养条件刺激有不同的敏感性，能脱分化以至分裂3）生长物质的影响，加入一些植物生长调节物质，可导致外植体细胞在细胞生物学上与细胞分裂有关的一些强烈变化4）光线的影响2022/10/183制作者：吴翠云4、愈伤组织的形成与调控：1）愈伤组织的形成过程，外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程可分为3个时期a诱导期，使外植体细胞进行分裂准备的时期，这一时期外植体细胞大小没有多大变化，但细胞内合成代谢活跃，细胞核体积明显增大。诱导期的长短有一系列内外因素决定b分裂期，经诱导期之后，外植体外层细胞开始迅速分裂，但外植体中间部分的细胞不分裂，这一时期由于细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速率，细胞体积迅速变小，逐渐回复到分生状态，这个过程即为脱分化。脱分化细胞不断分裂，从而形成了愈伤组织。愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质的枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累必须转到新鲜的培养基上培养，这个过程叫做继代。通过继代培养，可是愈伤组织无限期的保持在部分化的增殖状态，若让愈伤组织留在原来的培养基上继续培养而不继代，他们则会不可避免的发生分化处于分裂期的愈伤组织的特点：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明c形成期，细胞分裂由原来的局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成了瘤状或片状的拟分生组织，称为分生组织结节，分生组织结节可以成为遇上组织的生长中心，或进一步分化为维管组织结节2022/10/184制作者：吴翠云5、愈伤组织的生长于调控：试验表明愈伤组织的生长发生在不与培养基接触的表面。优良的愈伤组织至少具备以下特征：1）有旺盛的自我增殖能力2）容易散碎3）具有高度的胚性或再分化能力4）经过长期保存而不丧失胚性。为达到上述目的，在诱导愈伤组织时通常采取以下措施：1）选择适当的外植体2）选择正确的培养基3）采取特殊的物理或化学因素来改变愈伤组织诱导培养基和培养条件2022/10/185制作者：吴翠云7、器官分化和植株的形成，器官分化的结果是导致器官原基的形成，不同的器官原基则会分化成不同的器官，分化的器官中最主要是茎和根，它们分化的结果常导致完整植株的形成。在组织培养中通过芽或根形成植株的方式有三种：1）先产生芽，芽伸长后再在茎的基部长根形成完整的植株2）先长根，再长芽3）在愈伤组织的不同部位形成根和芽2022/10/187制作者：吴翠云

第四章植物器官的培养

器官培养包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。以器官作为外植体进行离体培养，是植物组织培养中最主要的一个方面，进行的植物种类最多，应用的范围也最广。2022/10/188制作者：吴翠云植物器官的培养如利用茎、叶和花器培养建立的试管苗，可在短期内提高繁殖速率，进行名贵品种的快速繁殖；利用茎尖培养可得到脱毒试管苗，解决品种的退化问题，提高产量和质量；将植物器官作诱变处理，用器官培养可得到突变株，进行细胞突变育种。2022/10/1810制作者：吴翠云植物器官的培养植物器官培养营养器官培养生殖器官培养根培养茎培养（包括茎尖、茎段）叶培养（包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶）花培养（包括花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药）种子培养（包括成熟与未成熟）胚胎培养（包括幼胚、成熟胚、胚珠、子房、胚乳培养）2022/10/1811制作者：吴翠云植物器官的培养第一节营养器官的培养一、离体根的培养二、茎尖的培养三、茎段的培养四、离体叶的培养2022/10/1812制作者：吴翠云营养器官的培养——根的培养（二）培养方法

1.培养基选择

White培养基；2/3或1/2MS和B5培养基注：离体根生长要求

提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养温度25－27℃，暗光培养。2022/10/1814制作者：吴翠云营养器官的培养——根的培养2.无性繁殖系的建立

种子消毒→→接种→→待根伸长后从根尖一端切取长1.2cm的根尖→→接种于培养基→→发育出侧根→→待侧根生长约1周后切取侧根的根尖进行扩大培养→→又迅速生长并长出侧根→→切下进行培养，如此反复→→得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。

3.培养条件

暗光和温度25-27℃。2022/10/1815制作者：吴翠云营养器官的培养——根的培养

4.植株再生培养

根段的离体培养也可以用来再生植株。第一步诱导形成愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导芽的分化、在愈伤组织上分化成小植株。离体根愈伤组织分化芽再生植株再分化培养基脱分化培养基2022/10/1817制作者：吴翠云植物器官的培养二、茎尖的培养1.茎尖培养概念及类型2.茎尖培养方法及步骤2022/10/1818制作者：吴翠云营养器官的培养——茎尖的培养

（一）茎尖培养概念及类型茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。

茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为：

微茎尖培养:

带有1-2个叶原基的生长锥,其长度不超过0.5mm

普通茎尖培养：较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短2022/10/1819制作者：吴翠云营养器官的培养——茎尖的培养茎尖培养的意义：

普通茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成苗时间短，加快繁殖。微茎尖培养可获得脱毒苗；2022/10/1820制作者：吴翠云营养器官的培养——茎尖的培养（二）茎尖培养方法及步骤取材材料处理及消毒培养接种驯化移栽2022/10/1821制作者：吴翠云营养器官的培养——茎尖的培养①直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（1－2cm）（取前可喷杀菌药，可顶芽或侧芽）。②从试管苗获取。1、取材取1-2㎝顶梢2022/10/1822制作者：吴翠云植物器官的培养——茎尖的培养3、接种

接种前再剥掉一些叶片，使茎尖0.5cm→→接种

要求：随切随接，动作迅速。亦可将切下茎尖材料在1－5%VC液中浸一下。2022/10/1824制作者：吴翠云植物器官的培养——茎尖的培养4、培养的方法和程序（1）培养基

①基本培养基MS、White、B5、

Heller培养基。

②蔗糖作碳源效果好，浓度2－3%。③激素（2，4-D，IAA，NAA）和有机添加物有明显影响。但激素浓度以0.1mg/L为宜，不要太高。2022/10/1825制作者：吴翠云植物器官的培养——茎尖的培养（2）初代培养条件

每天光照16h，照度1500-30001x，

温度25±2℃2022/10/1827制作者：吴翠云植物器官的培养——茎尖的培养（3）继代培养

茎尖长成的新梢→→切成小段→→增殖培养基中→→

1个月左右→→新梢又可切成小段→→再转入新培养基→→建立和维持了茎尖无性系。（即微型扦插）

继代培养可用MS培养基。2022/10/1828制作者：吴翠云植物器官的培养——茎尖的培养

（4）诱导生根

采用I／2MS培养基加入一定的生长素类调节物质，如NAA、IBA等。新梢基部浸入50或100mg/l的IBA溶液处理4-8h，然后转移到无激素的生根培养基中。2022/10/1829制作者：吴翠云植物器官的培养——茎尖的培养(5)驯化移栽入土

在生根培养1个月左右→→生长健壮而发达的根系→→炼苗→→移栽→→管理（温、光、湿、气）。2022/10/1830制作者：吴翠云植物营养器官的培养三、茎段培养（一）定义（二）目的（三）培养步骤2022/10/1831制作者：吴翠云植物器官的培养——茎段的培养

（一）定义：

指不带芽和带1个以上定芽或不定芽（包括块茎、球茎在内）的幼茎切段的无菌培养。

2022/10/1832制作者：吴翠云植物器官的培养——茎段的培养（二）意义：

快速繁殖；探讨茎细胞的生理特点进行育种上的筛选突变体的过程。2022/10/1833制作者：吴翠云植物器官的培养——茎段的培养（三）培养步骤

1.材料的选择和处理

（1）取材：当年生嫩枝→→去叶→→剪成3-4cm的小段→→自来水冲洗1-3h

注：生长期取芽，外植体取枝条顶部或中部茎段。2022/10/1834制作者：吴翠云植物器官的培养——茎段的培养（2）消毒与接种：将材料切割成1cm长短→→无菌条件下用75％酒精灭菌30-60s

→→0.1％升汞浸泡3-8min（饱和漂白粉浸泡10-20min）→→无菌水冲洗数次→→以备接种2022/10/1835制作者：吴翠云植物器官的培养——茎段的培养2.培养

(1)培养基的选择：MS+3％蔗糖+0.7％琼脂+激素（促进腋芽增殖6-BA﹥Kt和Ze）

(2)培养条件：保持25℃左右，给予充分的光照和光期

2022/10/1836制作者：吴翠云植物器官的培养——茎段的培养(3)继代培养：途径一：促进腋芽的快速生长优点：不会产生变异，方法简便，每年从一个芽可增殖10万株以上

途径二：诱导形成大量不定芽。优点：产生变异。

继代增殖过程注意选用培养基和生长调节剂。2022/10/1837制作者：吴翠云植物器官的培养——茎段的培养（4）生根培养

目的：使再生的大量试管苗形成根系，获得完整的植株。培养基选择：1/2，1/3或1/4的MS，B5培养基或White培养基，附加生长素（浓度NAA0.1-1.0mg/L，IBA和IAA可稍高）而降低或除去细胞分裂素。最好添加0.3％活性炭，以促进生根。2022/10/1838制作者：吴翠云植物器官的培养——茎段的培养

3.移植

移植是一个由异养转变为自养的过程。试管苗→→炼苗→→取苗→→洗净琼脂→→小心移栽→→苗期管理（初期湿度要大，基质通气湿润，保湿保温）2022/10/1839制作者：吴翠云植物营养器官的培养（一）定义（二）意义（三）培养方法四、离体叶的培养2022/10/1840制作者：吴翠云营养器官的培养——叶片的培养

（一）定义：

离体叶培养指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出茎和根。其中叶片培养是一个典型的代表。

2022/10/1841制作者：吴翠云营养器官的培养——叶片的培养（二）意义：1.是繁殖稀有名贵品种的有效手段；

2.可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题。2022/10/1842制作者：吴翠云营养器官的培养——叶片的培养（三）叶片的离体培养方法

发育方式：

叶片培养再生成完整植株有两种方式：①是直接诱导形成芽和根→→完整植株；

②是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化形成芽和根→→完整植株。

其中，以第二种方式最为常见。2022/10/1843制作者：吴翠云叶片离体培养发育方式（成苗途径）叶原基叶鞘叶片子叶叶柄愈伤组织茎和根试管苗

不定芽2022/10/1844制作者：吴翠云营养器官的培养——叶片的培养

1.材料选择及灭菌

取植物的幼嫩叶片，切割成适当大小（2—3cm），在流水中冲洗干净。再用70％酒精浸泡约10s

→→饱和漂白粉液中浸3-15min，或在0.1％升汞中浸3-5min→→无菌水冲洗数次→→无菌的干滤纸上吸干水分→→接种。注：细嫩与成熟叶片消毒时间不同2022/10/1845制作者：吴翠云营养器官的培养——叶片的培养接种

外植体大小：0.5cm2薄片（叶柄、子叶）上表皮朝上接种培养基。最好带叶脉，注意极性2022/10/1846制作者：吴翠云营养器官的培养——叶片的培养3.培养（1）培养基：

MS、B5、White、N6；蔗糖3%；2.4－D利于愈伤组织形成，NAA抑制芽形成，利于根发生，KT、6-BA利于芽形成。

愈伤组织诱导：BA1-3mg/L,NAA0.25-1mg/L；

分化培养：CTK2mg/L；

生根培养：NAA0.5－1.0mg/L

2022/10/1847制作者：吴翠云植物器官的培养——叶片的培养

3.培养

(2)培养过程：培养约2周至4周→→形成愈伤组织→→再分化培养基上（附加6-BA2mg／L）进行分化培养→→约10d左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点→→发育成无根苗→→生根培养基（附加NAA0.5-lmg/L）→→发育形成完整植株。2022/10/1848制作者：吴翠云植物器官的培养——叶片的培养(3)培养条件：

温度：25±2℃

光照时间：10-12h，光照强度：1500-3000Lx。2022/10/1849制作者：吴翠云植物器官的培养——叶片的培养

叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶组织的脱分化和再分化。

2022/10/1850制作者：吴翠云植物器官的培养第二节生殖器官的培养一、花器官的培养二、种子的培养三、胚胎的培养四、胚珠培养五、子房培养六、胚乳培养2022/10/1851制作者：吴翠云生殖器官的培养——花器官的培养一、花器官的培养2022/10/1852制作者：吴翠云生殖器官的培养——花器官的培养一、花器官的培养2022/10/1853制作者：吴翠云生殖器官的培养——花器官的培养一、花器官的培养（花蕾）

1.定义：花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。

2022/10/1854制作者：吴翠云生殖器官的培养——花器官的培养2、意义：通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用生产上也可用于珍贵品种的扩大繁殖。2022/10/1855制作者：吴翠云生殖器官的培养——花器官的培养3.培养方法

(1)取材、消毒

从健壮植株上取未开放的花蕾→

75％酒精浸润约30s→饱和漂白粉浸泡10-15min（或0.1％升汞中浸3-5min）→无菌水冲洗数次→接种。

2022/10/1856制作者：吴翠云生殖器官的培养——花器官的培养(2)接种花蕾培养：花梗插入培养基中。部分花器培养：切片接入培养基中。2022/10/1857制作者：吴翠云生殖器官的培养——花器官的培养(3)培养

培养基：MS、B5。附加生长素（NAA0.1mg/L）和细胞分裂素（6-BA2mg/L），诱导形成愈伤组织或胚状体，再分化培养成植株。2022/10/1858制作者：吴翠云植物器官的培养——花器官的培养培养条件：

温度：25±2℃

光照时间：10-12h，光照强度：1500-3000Lx

培养约1周，形成少量愈伤组织。再经1个月就分化出绿色芽点，再切割转接，可形成大量无根苗，经长根成植株，用于繁殖。2022/10/1859制作者：吴翠云植物器官的培养二、种子培养2022/10/1860制作者：吴翠云生殖器官的培养——种子的培养定义：

种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。2022/10/1861制作者：吴翠云生殖器官的培养——种子的培养2.意义：可以打破种子休眠，促进萌发；解决远缘杂种败育性，产生后代；快速繁殖苗木；

优点：植株分化容易，无菌操作方便2022/10/1862制作者：吴翠云生殖器官的培养——种子的培养

3.培养技术

(1)种子灭菌

种皮厚或不饱满的种子，宜用0.1％升汞消毒10-20min。幼嫩的或发育不全的种子，宜用饱和漂白粉消毒15-30min。若种子上有绒毛或蜡质，应先用95％酒精或吐温40处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。2022/10/1863制作者：吴翠云生殖器官的培养——种子的培养(2)培养基：A.促种子萌发用MS培养基，加或不加激素，诱导愈伤组织则可加入6-BA或2,4-D。B.无胚乳种子应适当加生长素。C.一般糖浓度为1-3%。D.打破休眠可加GA，或在接种前浸种处理。2022/10/1864制作者：吴翠云生殖器官的培养——种子的培养(3)接种培养

接种：把种子按每瓶3-5粒放人培养瓶中，均匀排列

培养条件：温度20-28℃1000-20001x光强，每天光照10-12h。2022/10/1865制作者：吴翠云植物器官的培养植物胚胎培养是胚及胚器官(如子房、胚珠)在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。三、胚胎的培养2022/10/1866制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养胚胎培养已有近百年的历史：1904年的Haning最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，并萌发形成小苗。30年代成功地把兰科植物的胚培养成小植株。40年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展。2022/10/1867制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养（一）胚胎培养的意义

克服远缘杂种的不育性；使胚发育不全的植物获得后代缩短育种年限；研究与胚发育有关的内外因素2022/10/1868制作者：吴翠云植物器官的培养——胚胎的培养（二）离体胚培养

离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚和幼胚培养。2022/10/1869制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养1.成熟胚培养指子叶期后至发育完全的胚。培养较易成功，在含有大量无机元素和糖的基本培养基上，就能正常生长成幼苗。将成熟或未成熟种子用70％酒精进行几秒钟的表面消毒→无菌水冲洗3-4次→无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。2022/10/1870制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养

培养基：

WhiteTukeyMS无机盐+糖(1-2%)+生长辅助物质(激素、AA、活性炭、维生素等)2022/10/1871制作者：吴翠云植物器官的培养——胚胎的培养

2.幼胚（未成熟胚）培养：

幼胚是指子叶期以前的幼小胚。

由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，其研究应用越来越深入广泛。幼胚培养技术：心形期胚或更早期的胚（长度仅0.1～0.2mm）胚越小就越难培养

幼胚培养成功的有大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等

2022/10/1872制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养（1）未成熟胚胎的培养有三种不同的发育方式：

a.

继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；

b.

早熟萌发，即培养后迅速萌发成幼苗；

c.

胚在培养基中发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。

2022/10/1873制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养（2）幼胚培养技术幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同，值得注意的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要细心，尽量取出完整的胚。

幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养和环境条件。2022/10/1874制作者：吴翠云植物器官的培养——胚胎的培养通常存在的影响条件如下：

a.培养基

幼胚对培养基要求较高，常用的培养基有Tukey，Nitch、MS，B5培养基；需要较高的蔗糖浓度，以提供较高的渗透压

2022/10/1875制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养b.生长调节物质

不同植物的胚培养需要的生长物质不同，如IAA可明显促进向日葵胚的生长；IAA，Kt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长；一般认为IAA可使胚的长度增加；加入BA可提高胚的生存机会；2022/10/1876制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养c.天然提取物的作用

椰乳对胚培养有一定的促进作用（番茄胚在含有50%椰乳的培养基中可维持生长）一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力

2022/10/1877制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养d.温光条件

对于大多数植物的胚来说，在25-30℃为宜早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以20℃为好。光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。2022/10/1878制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚胎的培养5.其它条件

胚培养中除要求较高的蔗糖浓度、高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机盐。

2022/10/1879制作者：吴翠云植物器官的培养四、胚珠培养（一）定义：

胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。2022/10/1880制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚珠的培养柱头花柱子房花梗花托花组成2022/10/1881制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚珠的培养胚囊卵细胞株心珠孔反足细胞珠被胚珠极核株柄2022/10/1882制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚珠的培养（二）意义：

胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。

2022/10/1883制作者：吴翠云生殖器官的培养——胚珠的培养（三）培养技术：

从花中取出子房→→70%酒精消毒30秒→→无菌水冲洗→→5%次氯酸钠液中灭菌10分钟→→无菌水冲洗数次→→在无菌条件下进行解剖→→取出胚珠→→放在培养