微生物培养、筛选与保存课件

一、复习二、微生物的生长曲线三、微生物的生长曲线的测定--方案汇报四、食品微生物检测11.微生物菌种的保藏为什么要进行菌种保藏菌种保藏的目的菌种保藏的原理菌种保藏的方法2

斜面低温保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法2、菌种的复壮

狭义的复壮－－消极的措施指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮－－积极的措施指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。菌种复壮的主要方法1、纯种分离法

菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌株纯”）

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。平板表面涂布法平板划线分离法琼脂培养基浇注法用分离小室进行单细胞分离用显微操作器进行单细胞分离菌丝尖端切割进行单细胞分离任务一：认识生长曲线的概念任务二：为生长曲线的绘制设计实验方案7任务一：什么是生长曲线10

将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。1112任务二：设计实验方案1.任选大肠杆菌或酵母菌2.结合实验室实际情况，设计实验方案，要求包括：（1）实验原理（2）材料与方法（3）预期结果15本次的作业：请大家设计实验方案，要求包括：（1）实验原理（2）材料与方法（3）预期结果A4纸打印上交四、食品微生物检测一、食品微生物的检验流程二、食品微生物样品采集与制备三、食品微生物检验1.食品中菌落总数检测2.食品中霉菌和酵母菌检测四、制定实验方案19食品检验的目的1.便于食品卫生质量监督管理；2.鉴别食品中是否存在有毒有害物质3.为新产品、新资源利用、新食品等进行卫生鉴定一.食品微生物检验的一般步骤样品采集样品处理样品保存选择参考菌群检验前的准备菌落总数大肠菌群致病菌分离培养分离培养增菌纯化染色镜检生化试验血清学试验动物试验结果报告二、食品微生物样品采集与制备取样：代表性微生物检验的取样过程中，避免操作引起污染。一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。22（二）样品的采集采样的步骤采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样→样品封存→开具采样证明食品微生物检验的采样方案微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案，其次使用正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。目前最为流行的抽样方案为ICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方案。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于8件。样品的种类大样，就是一整批；中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般每批抽样数量不少于5件，一般为200g；小样，也称检样，直接进行分析用的，一般为25g。食品微生物检验的采样方案ICMSF取样方案；美国FDA的取样方案；世界粮农组织（FAO）取样方案；我国的食品取样方案。ICMSF(TheIntermationalCommitteeonMicrobiologicalSpecificationforFood)国际食品微生物标准委员会食品微生物检验采样方法采样原则：

能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.1、液体样品采样方法

充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.2、半固体样品采样方法无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。

3、固体样品采样方法大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。

4、冷冻食品采样方法大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，应从深部取样。5、生产工序监测采样车间用水：从车间各龙头采样；车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖盖送检。平皿（七）采样标签的填写标签内容主要：

编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。×××××采样单样品编号：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━产品名称（商品名）______规格型号__________注册商标_____________生产厂家_______________通讯地址__________邮政编码□□□□□□受检地点_______________通讯地址__________邮政编码□□□□□□采样地点_______________采样日期__________采样基数______________生产日期_______________批号__________产品依据标准__________有效成分及含量____________________________________________________________检验目地________________检测项目_____________________________

采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。代表单位（章）代表单位（章）签字签字日期年月日日期年月日

备注

四.样品的送检要求1、要快速运送：不要超过3小时；2、若路途遥远，可在1~5℃低温下运送；3、要注意防污染、防散漏、防变质；4、要填写检验申请单。五.样品的处理方法（一）液体样品（二）固体样品（三）冷冻样品（一）液体样品的处理瓶装液体样品的处理盒装或软塑料包装样品的处理1.瓶装液体样品的处理

用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。2.盒装或软塑料包装样品的处理

将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。（二）固体样品的处理捣碎均质法剪碎振摇法研磨法整粒振摇法胃蠕动均质法1.捣碎均质法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，8000~10000r/min均质1~2min即可。视频：无菌均质器2.剪碎振摇法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。3.研磨法

将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。4.整粒振摇法直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。（三）冷冻样品冷冻样品，先将中样在0~4℃下解冻，时间不能超过18h，或在45℃下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。请大家参考p229附录五中国食品微生物限量规定列出的食品，选择一种制定样品的采集与制备方案，包括：1）选择何种食品2）用品准备3）样品采集具体操作步骤4）样品处理具体操作步骤作业要求：提交一篇小论文：XX菌落总数的检测报告前言：介绍实验背景一、材料与方法二、检测结果三、结果分析52参考论文三、食品微生物检验541.食品中菌落总数检测菌落总数：食品检样经过一定处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得1g（1mL）检样中形成的微生物菌落总数。菌落计数以菌落形成单位（cfu）表示国标规定：在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通琼脂平板上生长的细菌菌落总数不能生长的细菌：厌氧菌，微需氧菌，有特殊营养要求的，非嗜中温的细菌菌落总数主要用作判定食品被污染程度的标志55食品中菌落检测方法P116562.食品中大肠菌群检测大肠菌群：一群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。多存在于温血动物粪便。大肠菌群数的高低表明了粪便污染程度57食品中大肠菌群