动物基因工程及应用课件

1、本课程内容第一章 绪论第二章 基因克隆的工具酶第三章 基因工程的载体第四章 目的基因的制备第五章 目的基因导入和重组子的筛选第六章 外源基因的表达第七章 基因操作的基本技术第八章 植物基因工程及应用第九章 动物基因工程及应用第十章 医学基因工程及应用10/17/20221欢迎同学们听课！第九章 动物基因工程及应用第一节 动物基因工程的基本概念第二节 动物基因基因转移的方法第三节 动物基因工程应用10/17/20222欢迎同学们听课！引言20世纪70年代末至80年代初，借助于受精卵显微注射和早期胚胎细胞的逆转录病毒感染等手段，将功能基因引入高等动物的染色体DNA上，实现了种系内和种系间细胞的基因

2、转移。多利绵羊克隆的成功，意味着不仅可以将任何基因转入包括人体在内的任何细胞中，而且还能使转基因动物像重组微生物那样繁殖。10/17/20223欢迎同学们听课！10/17/20224欢迎同学们听课！第一节 动物基因工程的基本概念一、转基因与转基因生物转基因生物（Genetical modified Orgamism，GMO；Transgenic Organism，TO）：含有转基因并为其遗传修饰了的动植物发育为个体。转基因通常是指在基因操作过程中整合到动植物受体细胞基因组中的外源基因。从八十年代初以来，动物的转基因技术已得到了长足的进展，转基因鼠、绵羊。猪、兔、牛、鸡等都已相继获得成功，人类的

3、转基因技术目前局限在体细胞的基因治疗方面，具有遗传特征修饰的转基因人研究仍受到伦理学和法学的束缚，末能跨出第一步，但这并不意味着在技术上有不可逾越的障碍。10/17/20225欢迎同学们听课！一般的，显微注射可达几kb-250kb；酵母人工染色体（YAC)转基因至胚胎干细胞可达670kb；病毒为载体可转移的片段一般不超过20kb。（二）转基因的共抑制效应（Co-suppression）在转基因动物的研究中，转基因的表达特性常会出现许多出人意料又难以解释的现象。其中最普遍的现象便是转基因的失活，也称为转基因的沉默，这种现象在转基因动植物中均有发生。迄今为止，转基因的失活现象在转基因植物中研究得较

4、深入。研究表明，转基因的失活机制是转基因与内源基因（同源基因）的共抑制效应，即当受体细胞基因组中含有转基因的同源基因时，转基因与内源基因的表达同时受到抑制.10/17/20227欢迎同学们听课！I 共抑制效应的特征i 共抑制只发生在转基因与同源基因之间，而不影响其它基因的表达。ii 转基因与内源基因发生体内重组后，共抑制效应消失，基因表达恢复正常。iii 共抑制现象的发生与结构编码区有关，而与启动子的来源无关。iv 两个相同的转基因之间也发生共抑制效应，这也许是转基因动植物中单拷贝的转基因通常具有最高表达率的原因。II 共抑制效应的产生机制假说i 转基因与同源基因相互作用，形成某种后成状态而影

5、响两者的表达10/17/20228欢迎同学们听课！第二节 动物基因基因转移的方法一、动物基因工程的载体动物基因工程的载体主要有以下几种：.猿病毒（SV40）双链环状DNA，5226bp10/17/202210欢迎同学们听课！SV40的结构10/17/202211欢迎同学们听课！10/17/202212欢迎同学们听课！5. pBR322和BVP分子的穿梭载体在动物基因工程中，经常使用启动子有以下几种：热休克基因家族启动子pHS（热休克因子诱导）病毒长末端重复序列启动子（糖皮质激素）金属硫蛋白基因启动子（重金属诱导） 二、基因转移的方法动物基因转化的方法主要有：物理转化法，病毒介导法和工程胚胎干细

6、胞法。常用的方法主要有以下几种。（一）逆转录病毒感染法I 基本程序：1) 构建逆转录病毒DNA与质粒DNA的异源DNA型克隆载体。10/17/202214欢迎同学们听课！2) 克隆基因重组异源DNA型载体，在大肠杆菌等原核受体细胞中筛选、鉴定重组体。3) 通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞系（通常是小鼠细胞系）采用的方法包含：磷酸钙沉淀法，DNA+磷酸缓冲+CaCL2电穿孔法，脂质体包埋法4) 重组DNA分子转录出RNA重组分子，包装细胞合成包装蛋白包装成熟颗粒。5) 收集逆转录重组病毒，感染8细胞阶段的小鼠胚胎细胞。6) 利用标记基因筛选整合型转基因胚胎细胞。7) 移植入小鼠母体体内。

7、10/17/202215欢迎同学们听课！（二）DNA显微注射法I 基本程序：1) 通过激素疗法使田鼠超数排卵，48小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时田鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超数排卵为35个。2) 与雌性小鼠交配，然后杀掉田鼠，从其输卵管内取出受精卵。3) 将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内。4) 将25-40个注射转基因的受精卵移植入田鼠体内。5) 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代10/17/202217欢迎同学们听课！ 6) 从小鼠子代体内提取DNA样品，杂交鉴定转基因的整合与否及位点。7) 子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达I

8、I 优缺点：1) 优点：转基因范围广，且可转移较大DNA片段，可达数百kb；转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全。2) 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等。10/17/202218欢迎同学们听课！三、工程胚胎干细胞法多效性胚胎干细胞（ES）：胚胎发育到卵泡阶段的细胞能在培养基中体外扩增，重新输入到胚胎胚泡后，仍保留分化成其他细胞的能力。在体外培养时，ES细胞能方便地承受转基因操作而不影响其分化多效性，利用这个系统，一个功能转基因可被整合在ES细胞基因组中的一个非必须基因的特异位点上，构成工程化胚胎干细胞，经

9、过筛选鉴定，体外增殖，最后输回小鼠胚胎胚泡中，形成转基因动物，在这种方法中，整合的随机性可以避免。绝大多数的ES细胞不能整合DNA，采用正负选择方法可将整合在特异位点上的转基因ES细胞选出，并在体外富集这种细胞。10/17/202219欢迎同学们听课！I 转基因选择载体的构建转基因选择载体通常包括下列部分：1) 两个同源DNA片段（HB1,HB2），它们与ES细胞中某一必需基因两端同源，保证转基因及标记基因neor通过同源交换定向整合在ES的这一非必需基因内部。2) 转基因（TG），必须能赋予受体ES细胞新的功能。3) 新霉素抗性基因（neor）赋予受体细胞对G418的抗性4) 胸腺嘧啶激酶基

10、因（tR1、tR2），来自单纯疮疹病毒基因组的I型II型不同基因。tR基因实质上是自杀基因，其产物可将一种化合物（Gancyclovir，10/17/202220欢迎同学们听课！ GCV）转化成对细胞毒性的化合物，杀死细胞。II 转基因ES细胞的筛选1) 正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素G418的培养基中体外培养ES 细胞。由于重组分子是复制缺陷型的，所以在子代ES细胞中，重组分子已经转化入ES细胞的基因组中。2) 负选择法筛选出特异整合型ES细胞：如果非特异性整合发生，则两个tR基因或其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合，这时

11、用GCV筛选，其表达产物将杀死非整合型ES细胞，而特异性整合是通过双交叉同源交换实现的。因此两个tR基因就被排除，显示出GCV抗性，并生长。10/17/202221欢迎同学们听课！3) PCR法鉴定整合型ES细胞：制备ES 细胞染色体DNA，设计PCR引物，进行PCR扩增，鉴定外源基因是否在受体细胞中存在。P1：与neor基因同源（动物细胞内不存在neor基因）P2：与ES细胞染色体HB1基因左边外围邻近区域同源（CS区）不幸的是ES的多效性并没有发现在：牛、羊、猪、鸡中。10/17/202222欢迎同学们听课！转基因技术在基因研究中的应用，大致有三种情况：a. 同源重组灭活细胞内源基因转基因

12、进入动物细胞内后，通常会发生随机整合，这不能灭活内源同源基因。但当转基因与细胞内基因组中某区域具有高度同源性时，转基因便能准确地与基因组中的同源重组。但在高等哺乳类动物体内则十分罕见，其同源重组频率只及随机整合的千分之一。然而，如果在转基因结构中，携带一个灵敏的标记基因，便能有效地区分同源重组与随机整合，筛选出所期望的细胞株，并将之输回雌性动物的胚胎中。在其子代体内观察转基因的表型。b. 反义RNA或反义DNA抑制内源基因表达这种战略是通过抑制mRNA转录而关闭内源基因，10/17/202224欢迎同学们听课！而不是灭活内源基因本身，其方法有：1） 反义RNA体外合成：由mRNA作模板，细菌R

13、NA聚合酶催化合成mRNA的反义RNA显微注射进入受体细胞，阻止细胞内源基因的表达。2） 单链DNA体外合成：根据靶基因顺序，体外设计并合成一小段DNA单链（反义DNA），它与靶基因mRNA5端的翻译起始区互补，并抑制其翻译。然后将高浓度的单链反义DNA片段直接加入细胞培养基中，由于这种反义DNA分子量小，细胞会以较低的频率吸收。如果将这些反义DNA进行一些化学修饰，那么共转化效率和胞内的稳定性均会大幅度提高。3） 反义RNA的体内表达载体构建：构建原理是将靶基因反向接在一个强启动子的下游，10/17/202225欢迎同学们听课！（一）转基因鼠转基因鼠的应用主要是构建人类分子病研究和药物筛选试

14、验的模型，绘制高等哺乳动物尤其是人类基因组功能谱。转基因鼠模型可在短时间内刺激人体疾病的发生与发展，同时又能为基因治疗提供试验系统。如老人痴呆症、关节炎、肌肉营养不良症、肿瘤、高血压、变性神经病、内分泌功能紊乱，心血管冠状动脉疾病等。现以老年痴呆症为例：老年痴呆症是一种变性脑机能紊乱疾病。其特征是：抽象思维和记忆力的损失，甚至发生语言障碍。虽然在60-65岁的老人中约有1%，80岁以上的老人中30%患有此症，但临床诊断及治疗效果较差，原因是病理不详。10/17/202227欢迎同学们听课！ 在老年痴呆症病人脑的新皮层和海马中，神经原纤维粘团在神经元细胞体内大量积累。一种叫做老化斑块的稠密聚集体

15、在轴突末端形成。而脑细胞神经元消失了。另外，在脑血管中还存在着一些称为淀粉状体的蛋白聚集物。老化斑和淀粉状体的主要成分是一个4KD的蛋白，称为bA4或b蛋白。它是b- 淀粉前体蛋白（APP）的内源蛋白酶水解产物。b蛋白的积累原因不详。在那些老年痴呆症患病频率较高的家庭成员中，APP基因上有突变。因此认为突变的APP基因是该病的病因。但是在人体中几乎无法研究该病的发生与发展过程。研究者们发现在小鼠的某些种系中产生老化斑。而另一些种系则不产生。因此，后一种种系小鼠10/17/202228欢迎同学们听课！ 可转基因的受体。将APP基因转入鼠体内研究老年痴呆症的分子机制。相应的载体也已构建出来。它包括

16、一个来自于脑特异性病毒的启动子区域，人APP基因的一部分（编码c末端100个氨基酸）。然后用此重组分子构建转基因鼠。并已确定转基因在脑神经元中表达。出现相应的症候群。但APP基因损伤的机制是什么，目前尚在研究中。兔、猪、羊的转基因也获得了成功，但成功率较低，只有鼠的15%，平均每200个被注射的卵细胞仅有一个能发育成转基因动物。转生长素基因的猪生长期明显缩短，饲料利用率提高，廋肉比增加。10/17/202229欢迎同学们听课！(二）转基因牛转基因牛主要目的是改善牛奶的组成：增加奶酪比和降低乳糖的含量。牛奶中奶酪的含量与k-酪蛋白的含量正相关。因此，通过k-酪蛋白转基因的过量表达是增加牛奶k-酪

17、蛋白含量的理想途径。同样，乳糖酶转基因在乳腺中的表达能导致产生无乳糖牛奶，这种牛奶深受那些对乳糖过敏或消化不良的人的欢迎。转基因牛的另一目的是构建抗菌、抗病毒、抗寄生虫感染的新品种。原理是转抗体基因或转病毒细菌蛋白基因，进行体内免疫。现在的大型养牛场控制感染的方法是用疫苗免疫。药物医疗以及物理隔离，其成本是养牛生产总成本的20%。10/17/202230欢迎同学们听课！ 转基因牛的构建方法：将转基因小鼠的DNA显微注射技术稍加修改后即可用于构建转基因牛：1) 从屠宰场杀死的母牛体内收集卵母细胞2) 体外诱导牛卵母细胞3) 用公牛精子使卵母细胞体外受精4) 离心受精卵以除去卵黄（它的存在不利于用

18、显微镜观察雄性原核）5) 将转基因显微注入雄性原核中6) 体外培育受精卵至囊胚阶段7) 将胚胎移植到处于发情期的母牛体内8) 在子代中检测转基因产物，每2470个卵细胞可获得两头转基因小牛.10/17/202231欢迎同学们听课！（三）其它转基因动物鸡的卵比较小，显微注射法不可用，主要是利用逆转录病毒感染受精卵的方法进行基因转移。转基因鸡改造的主要是抗病性状。鱼的转基因也已经获得了成功，鱼的卵排出体外，易于收集，采用显微注射法，注射后35-80%存活率，总有效率10-70%。已经在鲤鱼、鲶鱼、鲑鱼、罗非鱼上成功。将鲑鱼生长素cDNA与鳕鱼抗冻蛋白启动子及polyA信号转化大西洋鲑鱼，使其体重明

19、显增加。3.3 利用转基因动物生产生物大分子用于生产生物大分子的转基因动物称为动物生物反应器，或动物个体表达系统，具有广阔的应用前景。10/17/202232欢迎同学们听课！现在建立转基因小鼠的技术已经成熟，可用作研究转基因大动物的一种模型。以建立转基因家畜，生产蛋白质或多肽类药物等生物大分子。 a. 动物生物反应器的组织选择 作为动物生物反应器的器官或组织都选用乳腺。因为乳汁可以连续分泌，流体含量丰足，频繁收集不会干扰动物正常的生理状态。转基因产物是在动物体内产生的异源蛋白。因此对人体不易产生免疫反应。另外，动物乳汁中只有为数不多的十几种蛋白质，且其含量及性质均已知。转基因产物的分离纯化十分方便。其优点简述为：1）含量丰富，连续生产；2） 对动物不构成危害；3） 转基因产物对人不易产生免疫反应；4） 分离纯化方便。10/17/202233欢迎同学们听课！目前已可在小鼠、家兔、绵羊和猪的乳汁中生产转基因产物：乳铁蛋白、牛乳清蛋白、绵羊乳球蛋白、人的t-PA、人IL-2、人 a-抗胰蛋白酶等。b. 动物乳腺分泌转基因产物的研究模型转基因鼠可用作转基因产物在乳腺中表达并将之分泌到乳汁中的研究模型。如囊状成纤维疾病（CF）是一种遗传病，在欧洲血统的新生儿中每2500人就有一人患此病。一个有缺陷的CF表达异常的纤维转膜调控蛋白（CFTR）。正