定性免疫学检验的性能验证与质量控制

1、 杨方华 定性免疫学检验的性能验证与质量控制CNAS-CL39：2012医医学实验验室质量量和能力力认可准准则在在临床免免疫学检检验领域域的应用用说明：检验方法法和程序序的分析析性能验验证内容容应参考试试剂盒说说明书上上明确标标示的性性能参数数进行验验证，至少应应包括：检出限、符合率（采用国国家标准准血清盘盘或临床床诊断明明确的阴阴阳性样样品各20份或或与其他他分析方方法比对对），精密度（包括重重复性和和批间精精密度）；并应应明确检检验项目目的预期期用途，如筛查、诊断、确认。一、定性性免疫试试验的性性能验证证筛查试验验诊断试验验确认实验验C50C5C95性能验证证相关概概念一份样本本，在多多次

2、重复复实验中中各有50%的的几率获获得阳性性或阴性性的结果果时该分分析物的的浓度。对特定定试剂， C50一旦旦确定，是恒定定不变的的。临界点（C50）浓度度的定义义C50一份样本本，在多多次重复复实验中中有95%的几几率获得得阴性结结果时该该分析物物的浓度度。C5浓浓度的定定义C5一份样本本，在多多次重复复实验中中有95%的几几率获得得阳性结结果时该该分析物物的浓度度。C95浓浓度的的定义C95质控品：商用或或自备，含阳性性和阴性性。C50和和C5（C50-20%）及及C95（C50+20%）浓度样样本：用用于重复性及及最低检检出限验证，不不少于40次检检测量。临床样本本或血清清盘：用用于准确

3、性验证，不不少于50份阳阳性和阴阴性样本本。性能验证证的样本本准备纯定性试试验：采用浓度度接近临临界值的的分析物物作为检检测材料料，不宜采用用阴性低低值或强强阳性样样本来评评价定性性检测方方法的不不精密度度。量值化定定性试验验：以COI（cut-off Index）或S/CO比值作作为分析析方法的的精密度度评价指指标。（一）不不精密度度的验证证定性测定定精密度度分析质质量指标标为C5-C95浓度度区间（亦即“灰区”），这一区间间范围C5020%。纯定性测测定不精精密度的的评估方方法分析物浓浓度接近近临界值值时的不不精密度度曲线两种不同同方法的的不精密密度曲线线比较检测试剂剂或系统统的说明书可能

4、会注注明分析析物的临临界浓度度，但需需验证。如果临界界浓度未未知，则则可以将将阳性样样本进行行一系列列稀释，然后将将他们进进行重复复检测以以确定能能够获得得50%阳性和和50%阴性结结果的那那个稀释释度，这这一稀释释度的分分析物浓浓度即为为临界点点（C50）。如何获得得 “临临界点（C50）”制备评价价用样本本制制备备3份样样本：一一份浓度度为C50，一一份为C50+20%，一份份为C50-20%。每份样本本的体积积需保证证40次次或更多多次重复复检测的的需要。评价方法法每每份样本本检测40次，确定每每一份样样本结果果为阳性性和阴性性的百分分比。纯定性试试验不精精密度评评价步骤骤-20%+20

5、%浓浓度范围围在C5-C95区间间之内；用该方方法检测测，浓度度超过C5020%的样本本检测结结果不一一致；此此结论错错误率5%，需使用用更宽浓浓度范围围的样本本（如30%）进行行另外的的试验。不精密度度评价结结果判断断-1-20%+20%浓浓度范围围包含了了C5-C95区间；用该方方法检测测，浓度度超过C5020%的样本本检测结结果一致致不精密度度评价结结果判断断-2用该方法法检测，C50+20%的样样本检测测结果一一致，C50-20%的样本本不一定定能得到到一致结结果；需需要用低低于C50更大大百分率率浓度的的样本（如-30%）进行补补充试验验。不精密度度评价结结果判断断-3用该方法法检测

6、，C50-20%的样样本检测测结果一一致，C50+20%的样本本不一定定能得到到一致结结果；需需要用高高于C50更大大百分率率浓度的的样本（如+30%）进行补补充试验验。不精密度度评价结结果判断断-4有些定性性免疫测测定，如如ELISA等等，样本本的测定定结果可可以COI（cut-off Index）或S/CO比值来来表示，检测系系统或试试剂厂家家会在其其试剂说说明书中中给出试试剂的批批内和批批间变异异，这对对于对实实验室评评价试剂剂的精密密度以及及评估其其室内质质控的批批间变异异结果有有参考价价值。分为批内内精密度度评估和和批间精精密度评评估数值化定定性免疫疫测定的的精密度度评价方方法操作者

7、必必须熟悉悉检测系系统工作作原理，了解并并掌握仪仪器的操操作步骤骤和各项项注意事事项，应应在评估估阶段维维持仪器器的可靠靠和稳定定。用于评估估试验的的样本一一般常采采用临床床实验室室收集的的血清(浆)样样本；当当实验室室收集的的样本不不稳定或或不易得得到时，也可考考虑使用用稳定的的、以蛋蛋白质为为基质的的商品物物质，如如校准品或或质控品品。精密度评评估的基基本原则则（1）评估精密密度时，应至少少评估两两个浓度度水平样样本的精精密度。所选样本本浓度应应在测量量范围内内有医学学意义，即至少少有一个浓度度在医学学决定水水平左右，在在定性测测定，即为接近近临界水水平的浓浓度。精密度评评估的基基本原则则

8、（2）评估方法法：三个个不同浓浓度的样样本，在在一个测测试批内内重复进进行至少少20次次检测，计算所所得S/CO值值的均值值和SD，计算算批内CV%。质量控制制：检验验时应同同时至少少测一个个质控品品。判断结论论：应试剂说说明书所所标明的的批内变变异。ELISA的批批内变异异CV%应10%。批内精密密度的评评估评估方法法：三个个不同浓浓度的样样本，在在10天天以上时时间内单单次重复复进行至至少20批检测测，计算算所得S/CO值的均均值和SD，计计算批间间CV%。质量控制制：判断结论论：应试剂说说明书所所标明的的批间变变异。ELISA的的批间变变异CV%应15%。批间精密密度的评评估检测限（li

9、mitofdetection）是指指检测方方法可检检测出的的最低被被测量浓浓度，也也称检测测低限（lowerlimitofdetection）或最最小检出出浓度（minimumdetectable concentration），有时也称称为分析析灵敏度度（analyticalsensitivity）。如前所述述，分析析物浓度度位于C5-C95区区间之外外（小于于C5或或大于C95）时，候候选方法法对同一一样本的的重复性性检测将将得到相相同结果果。因此此，C95代代表了某某一试剂剂可以测测出的最最低被测测量浓度度。（二）检检出限的的验证样本选择择：评估估试剂分分析灵敏敏度所使使用的样样本，如如检

10、测项项目有国家参考考品，则可使使用国家家参考品品或经国国家参考考品标化化的参考考品进行行检测，如没有有国家参参考品，则使用用可以溯源源或量化化的样本，如国际际标准物物质，或或与国际际标准物物质溯源源的样本本。验证方法法：处于于测定下下限浓度度（C95）的的样本，重复检检测20次，应应至少有有18次次以上为为阳性反反应。检出限的的验证方方法验证方法法及指标标：以与临床诊断断、金标准方方法和标准血清清盘的检检测比较来评评价，常常以敏感性（包括临临床敏感感性）/特异性（包括临临床特异异性）和和阳性符合合率/阴阴性符合合率来表示。（三）准准确度验验证临床敏感感性：在在患有明明确临床床疾病的的患者中中，

11、其检检测结果果呈阳性性或者超超过正常常值范围围的比率率 （即即出现阳阳性结果果和确定定患者患患病）。临床特异异性：在在没有特特定临床床疾病的的患者中中，其检检测结果果呈阴性性或者在在正常值值范围内内的比率率。临床特异异性和临临床敏感感性阳性预测测值：即即测定为为阳性的的标本实实际上为为阳性的的可能性性。=真阳阳性/（真阳性性+假阳阳性）100%阴性预测测值:则则为一份份给出阴阴性结果果的样本本实际上上为阴性性的可靠靠性。= 真真阴性/（真阴阴性+假假阴性）100%阳性预测测值和阴阴性预测测值试剂的检测结果共计分析物阳性分析物阴性阳性结果数TPFPTP+FP阴性结果数FNTNFN+TN共计TP+

12、FNFP+TNTP+FP+FN+TN敏感性100%特异性100%阳性预测值100%阴性预测值100%符合率100%TP分析物存在时检测结果为阳性的数量。FP分析物不存在时结果为阳性的数量。TN分析物不存在时检测结果为阴性的数量。FN分析物存在时检测结果为阴性的数量。 敏感性、特异性性和阳性性预测值值、阴性性预测值值的计算算作为筛查查试验，检测的的敏感性应95%；作作为诊断断试验，检测敏感性和和特异性性均应95%；作为确确认试验验特异性性应98%-99%。定性免疫疫检验项项目敏感感性、特特异性要要求如果没有可用用的诊断断标准，那么需需提供待待评价试试剂与某一已已验证方方法进行行比较的结果，在这种

13、种情况下下，则不不能够计计算敏感感性和特特异性，而是计计算阳性性符合率率和阴性性符合率率。这种计算算反映的的并非方方法的准准确度，而是待评价试试剂和已已验证方方法的一一致性程程度。阳性符合合率和阴阴性符合合率待评价试试剂与已已验证方方法相比比较进行行阳性符符合率和和阴性符符合率的的计算阳性符合合率和阴阴性符合合率的计计算待评价试剂的检测结果已验证方法+-+ab- cd共计a+cb+d阳性符合合率=a/(a+c)100%。阴性符合合率=d/(b+d)100%。总符合率率=(a+d)/(a+b+c+d)100%。第三方质质控品检测系统统配套质质控品自制质控控品质控品的的来源二、检验验结果质质量的保

14、保证-室内质质控基质：应应尽量选选择人血清基基质，动物源源性的基基质由于于人体内内有大量量的异嗜嗜性抗体体的存在在引起假假失控。稀释液液也应用用人血清清，冻干干品复溶溶可以使使用生理理盐水。稳定性：有效期期为6个月以以上,实验室应应对有效效期进行行验证。质控物的的选择质控物数数量、实实验位置置和频次次：质控控物数量量应满足足一个批批号至少少半年的实验量量。每分分析批至至少安排排一个弱阳性和一个阴性质控(高值阳性性血清只只用于监监控“HOOK效应”)。检测位置置不能固固定而应应随机放放置。试剂盒所所设的阴、阳性性内对照是用来计计算CUTOFF值及有效性性判断标标准，只能在在同批号号试剂内内使用，

15、不能作为为质控指指标，质控必须须是可以以监控到到不同批批号试剂剂间的变变化的外对照。质控物的的选择阴性质控控品：特定项项目人阴阴性血清清混合物物（若为为ELISA质质控品浓浓度宜0.5倍倍临界值值左右）阳性质控控品：特定项项目人阳阳性血清清混合物物ANA1:1000anti-dsDNA1:100或以以上anti-ENA中中强度阳阳性：若若组合式式检测，至少有有2个项项目为阳阳性质控物的的选择弱阳性质质控品：ELISA：临临界值24倍倍的样本本IIF:比临界界值高1个滴度度。特定定项目人人阳性血血清或阴阴阳性血血清混合合物。ANA：1：1001:320 ，ANA荧荧光模型型：均质质型，颗颗粒型，

16、核仁型型，或胞胞浆型等等（可以以每6个个月变换换，存储储质控品品至少有有2个模模型）anti-dsDNA：1:101:32anti-ENA：低低度阳性性或临界值24倍倍的样本本（若组合合式检测测，至少少有2个个项目为为弱阳性性）质控物的的选择1 收集集阳性血血清(无无明显溶溶血、黄黄疸、脂脂血及污污染血清清)到一一定量（至少够够本室使使用6个个月以上上）；2 传染染性病原原体需经经56、10小时灭灭活后使使用；3 0.2m生物滤滤膜过滤滤，去除除纤维沉沉淀物和和细菌；4 稀释释：用正正常人血血清稀释释；5 定值值：与定定值参考考品进行行对比、求值，无参考考品时选选择在2-4倍CutOff值值附

17、近的阳阳性值；6 分装装小瓶（每日用用量），加盖、贴签，-20冻存存备用；7 稳定定性及瓶瓶间差评评价。自制质控控品不同保存存条件下下：2-8：CV值值（滴度度符合率率）、累累计CV值（符符合率），稳定定期-70：CV值、累计CV值，稳定期期室温：CV值值、累计计CV值值，稳定定期1）均一一性评估估：同批批号质控控品随机机抽取5支（瓶），80%符合为合合格。2）稳定定性评估估：评估估1周，1月，3月，6月，1年。有效期期一般可可标定为为1年。质控品稳稳定性的的评价纯定性试试验：如免疫印印迹、免免疫金标标等，除除膜条本本身的内内对照外外：每检测日日或分析析批，应应使用弱弱阳性和和阴性质质控品两两

18、个水平平进行质质控。质控判定定规则阴性质控控品的检检测结果果为阴性性弱阳性质质控品的的检测结结果为弱弱阳性纯定性试试验的质质控要求求如：抗ENA抗抗体谱检检测以滴度或或稀释度度判定的的试验：如间接接免疫荧荧光法、凝集试试验等。每检测日日或分析析批，应应使用弱弱阳性和和阴性质质控品两两个水平平进行质质控。质控判定定规则：阴性质控控结果为为阴性弱阳性质质控结果果在靶值上下下一个滴滴度或稀稀释度纯定性试试验的质质控要求求如：ANA、ANCA等用数值判判定结果果的试验验：如ELISA等。浓度：弱弱阳性质质控品浓浓度宜在在24倍临界界值左右右，阴性性质控品品浓度宜宜0.5倍临界界值左右右（两个个水平）。频次：ELISA应每每板做质质控。质控判定定规则：至少利利用其多多规则中中一个偶偶然误差差及一个个系统误误差规则则。12s警告，13s和22s失控。数值化定定性试验验的质控控要求发现问题题分析问题题产生的的原因采取纠正正措施加加以改进进，进而而预防验证和追追踪避免同样样的问题题出现第第二次！失控原因因分析及及处理阳性质控控品失控的常常见原因因:加加样不准准、温育育时间不不稳定、偶然误误差。阴性质控控品的常见失失控原因因：污染染、洗板板不干净净