丛枝菌根实验方案

1、 13丛枝菌根试验方案李晓林(1990)30 m 不能排解外界微生物及浇灌施肥等措施造成的影响 丝分别开来，使菌丝进入菌丝室，而将根阻挡在菌根室中，不让二者混在一起，为深入争辩菌根菌丝的生理生化特性供给的技术和方法。Glomus intraradices 44 m 117 m77 m，呈椭球形或(41 图版I 6)Gmargarita孢子和 Ssinuosa 孢子果的萌发。虽然较前两种孢子和孢子果的芽管数略少，但它仍很快。Gintraradices 菌丝的分枝呈垂直方向。生成的菌丝较联孢菌丝直径更细，对根段进展侵染会更简洁。9cm 的培育皿底部，30 m 的尼龙网黏贴在有机玻璃条及培育皿壁，直

2、至培育皿上盖，阻挡根的进入(图 42)。将转移 RiTDNA GintraradicesSchenck&Smith 丛枝菌根真菌孢子，共同培育的室称为菌根室(MC)(HC)42 培育皿中的两M 10mL 倒入菌根室中，用于离体双重培育丛枝菌根真菌与转移RiTDNA 胡萝 I-10mL NO -N3NH -N(N 的含量与M pH 4溴甲酚紫作为指示剂；倒入10mL 不含蔗糖的M 培育基，pH 55。在相应的菌根Gintraradices M 培育基上生长的转移RiTDNA i-根的5cm-7cm Gintraradices 孢子直径小，每个培育皿移进30 个孢子。将培育皿在271的恒温培育箱中

3、黑暗培育。菌根室中共生联合体生长状况：Gintraradices 菌根真菌相像于Gmargarita菌根真菌， 基质中形成了大量的养分孢子及成熟的孢子(图 43)。养分孢子的大小为 4l m-62 m49 m67 m 93 m78 m。物质。质的双向流淌有助于进一步探究菌丝对物质运输的作用驱动力(Smith，1997)。孢子不仅是作为丛枝菌根真菌养分储存的器官，更是一种稳定 心法(李晓林、冯固，2023)。这些方法的共同点都是能够将菌根孢子从生长基质中富积起来，但是孢子与基质的小颗粒特别是沙粒颜色相近，不易于区分。测定丛枝菌根孢子密度方法一：常规的湿筛倾析法(Gerdemann 和 Nieol

4、son，1963)：(1) 称取确定重量的土壤样品，放在容器内用水浸泡20min-30min，尽量使土壤松散。假设 (2m一034 m 面略微倾斜。(3)用玻璃棒搅动浸泡土壤的水溶液，停置几秒钟后，使大的石砾和杂 物筛面的一个点上，避开整个筛面都沾有土壤溶液。(4)用清水依次轻轻冲洗停留在筛 面(5)将滤液通过细筛并用水冲洗。在不同直径的孢子。(6)将含有筛出物的培育皿放在双目实体解剖显微镜下观看并计数。测定丛枝菌根孢子密度方法二：湿筛倾析染色法(简称染色法)改进的湿筛倾析法，前 4 步骤同方法一。(5)用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的试管内，滴 90。C 水浴锅或烘箱中加热半

5、小时，进展染色。(6)将染色后的滤液通过细筛，并冲洗筛上的滤物，可洗去染色剂，将筛出物放在清洁的培育皿里。在的孢子。(7)将含有筛出物的培育皿放在双目实体解剖显微镜下观看并计数，可观测 到紫色孢子。两种方法对菌根孢子的形态特性以及测定精度比较 据。孢子在土壤中主要呈无色透亮、白色、淡黄、黄棕、棕色、金黄、红棕和黑色等颜色(李晓林、冯固，2023)，很多孢子的颜色与基质沙土的颜色相近，在计数时不易被区分 (51 图111)(52 图版一2)，通过湿筛倾析法筛选出的菌根孢子或多或少带有菌丝，菌丝同时也被染色，与四周沙粒颜色反差较大，观测孢子形态特性比较明显，孢子的图51 湿筛倾析法观测到孢子形态(

6、棕黄色)52 染色法观测到的孢子形态(紫色) 后的孢子(紫色)比没染色的孢子(棕黄色)易于观测，可以明显地提高计数工作效率。以 宁夏大武口煤矸石山接种菌根处理的沙土样品为例 来统计孢子密度，10g 350 个。而利用染色法来测定一样样品的380 个。每个土壤样品精度上平均提高了8，染色法较常规的湿筛倾析 为误差，提高了孢子密度测定的精度，染色后的孢子(紫色)比没染色的孢子(棕黄色)易 品为例，本试验条件下以传统的湿筛倾析法来统计孢子密度，10g 沙土样品孢子数平均350 380 平均提高了 8，染色法较常规的湿筛倾析法更易于识别和识别，提高了孢子密度测定的精度。(350 个孢子10g)25mi

7、n30min 1 个样品(380 个孢子10g)1 个样品缩(25 min-30min)，本试验 40 个土样，在测定速度上节约 1000min 一 大规模样品的孢子密度监测供给了一种快速的方法种可行的快速测定方法。该方法与常规的湿筛倾析法相比，也存在缺乏，经过在 90 水浴锅或烘箱里加热 30min 染色后的孢子失去了活力变成了死孢子，孢子不能再发芽 丛枝菌根的种类和活性，因而不适合用于收集活孢子。55 小结(1)染色法对于陕速测 定丛枝菌根孢子密度总量是可行的，精度较高，对于大批量样品孢子密度的测定可行。(2)染色法缺乏之处是孢子经高温加热和染色，不同种或属孢子不易于识别，活孢子数 量不能

8、够统计准确。因此本方法不适合测定活性孢子密度统计。10-100g 10-100m1500-1000ml 水，搅拌，静10s 后过双层分样筛(20 400 目)。反复冲洗待测样品并过筛3-4 次，收集400目筛子上的残留物于大离心管中3000min离心3min450的蔗糖，搅匀后快速放人离心机，1500rmin 15min 400 目筛，再用。菌根侵染状况观看与侵染率测定：(1)活体镜检法：将要检查的植物冷静器或田间轻轻 发育状况，并可节约植株。缺点是并不格外准确。(2)染色镜检法：为了准确检查菌根 发育状况、测定侵染率，则需承受染色法。一般要经过根系透亮染色分色过程。具体FAA 固定的根系剪成

9、长 0.5-1.0cm 小段放人试管或其他染色容器，参与5-10KOH 溶液，放在9020-60min，通常草本植物的幼嫩根系透亮时间较短，而木本植物的根系则较长。去掉碱液然后用自来水轻轻冲洗根系3 次，2HCl 5min。去掉酸液后参与酸性品红(001)乳酸甘油染色液(875ml63ml63ml01g)90水浴锅内20-60min，或室温下过夜。回收染色液可重复再用。参与乳酸分色后即可镜检、如用乳酸酚翠盘蓝(005)染色液(300g250ml250ml300ml；翠盘蓝(Trypan blue 05g)则不必参与HCl 酸化，可以直接染色，并可用水分色。植物细胞不着色(有时中柱着色)，真菌组

10、织染成红色(酸性品红染色)或蓝色(翠盘蓝染色) 用的有方格穿插法和根段频率标准法(BiermannLindermanl981) 而准确的根段频率标准法。该方法测定的结果在确定程度上能反映出菌根侵染的程度。将经过上述染色处理的根样，用镊子和挑针选择25 条粗细全都的根段整齐地排列在干净200 下检查每条根段的侵染状况，依据每段根系菌根构造的多少按0，10，20，30， 100的侵染数量给出每条根段的侵染率。例如，没有菌根构造的根段其侵染率为 0， 假设100，只有一半长度的根段被侵染形成菌根的则该根段的侵染率为 50，依此类推，并记录各侵染率下根段的条数。依以下公式即可计算该样品菌根的侵染率。另

11、外，可利用目镜测微尺测定单位根系长度泡囊、侵入点的数量。对于脂胶、五色指甲油等封固后可长期保存。丛枝菌根真菌的接种方法丛枝菌根真菌有多种接种方法当的接种方法然而不管承受何种方法操作人员和有关器具必需在接种前进展消毒处 理，以尽量削减污染的时机。对需要接种处理的植物种子、根系培育植物用的各种容 器和培育基质苗床和苗圃土壤等都要消毒甚至灭菌对于大田土壤有条件的最好也进 行消毒处理。另外，必需留意，接种剂类型、接种物形式、剂量和接种方法的不同会直接影响(施亚琴等1993，Yineta11997)丛枝菌根真菌的接种效果一、按接种物形式区分的接种方法孢子接种法即以丛枝菌根真菌的孢子作为接种物进展接种处理

12、是 常用的接种方法可先将孢子从菌剂中分别出来挑到滤纸上或放进盛有生理盐水的小 瓶中便可用来接种假设菌剂中只含有孢子可依据单位重量或单位体积孢子含量直 接参与确定重量或体积的菌剂。按孢子用量又可进一步分为： (1)单孢接种即只挑一个孢子用来接种。通常用于菌种纯化分别、分类鉴定等争辩目的事先在灭菌沙中 播种烟草等寄主植物，培育至36 片真叶，即可用于接种处理。解剖镜下用毛细管把孢子直接放在幼苗根系上，然后将该苗定植于育苗器中，承受半水培法培育24 周后一般即有菌根侵染。(2)双孢接种挑出两个相像的孢子接种，类似于单孢接，但接 种成功的时机大于单孢接种法。(3)多孢接种即选择外部形态全都的3 个或多

13、个孢子进展接种可以大大提高接种成功的时机但有时所接孢子可能不是来自一个种因 此，该法不宜用来菌种纯化、分别鉴定等工作。但可用于生理效应、生态等争辩工作， 如一般每棵幼苗可接5001000 个孢子。2根段接种法将已充分形成菌根的根段 (侵染率达80以上，且含有较多泡囊)，剪成小碎段，可用作接种物。一般每个养分钵接种0205g 颖根段即可无论颖或风干的根段均可测定出接种势单位数量。依据需要的接种势单位数量，换算成根段长度或重量，即可接种。3培育基质接种法 是最常用的丛枝菌根真菌的接种方法。由于用石英砂、纯洁的河沙、蛭石、沙土等作培育基质来生殖菌种。因此，这些培育基质中含有大量孢子、菌丝、菌根根段(

14、和)孢子 果等生殖体其接种势较大且颖的接种物优于风干的用此培育基质接种物作菌剂， 侵染成功率高速度快具体操作上可依上述方法测得单位重量或体积培育基质接种物 的接种势单位数量一般每个养分钵或每盆可分别参考施用5000 或10 000 接种势单位；对于苗圃或大田可按每m2 为5X10*一5X10接种势单位的菌剂进展接种。二、按接种部位区分的接种方法1对种子接种是播种时或播种前对种子进展的接种处理。依据不同处理方式又可将其分为：种子球衣化接种法种子球衣化是生产上常用的 方法大体作法是将接种物粘合剂与种子一起经过球衣机加工使种子外表包围一层 均匀的接种剂，凉干后便可播种。此法本钱较高拌种接种法：将接种

15、剂与种子拌匀 后再播种。2对幼苗根系接种对各种来源的组培苗、脱毒苗、少于6 片真叶的生长在灭菌基质中的幼苗均可将接种剂直接放到根系上或根系四周此法菌根侵染速度 较快，假设用颖的菌剂则侵染速度会更快。3对容器接种当前越来越多的经济作物承受各种容器育苗如纸质或塑膜养分钵各种育苗器花盆等均常用来短期培育 或栽培植物。可将菌剂与灭菌后的培育基质混匀装入容器，然后播种或定植幼苗。也 可先将灭菌后的培育基质装入养分钵或育苗器中在培育基质上挖数个将接种剂 放人穴内或将接种剂放在容器中部然后在培育基质外表播种此法的特点是因容器 体积限定了根系的扩展范围同时由于菌剂比较集中故有利于强迫侵染可以培育出 优质菌根苗

16、，当其侵染率达50以上时，便可移栽到苗圃或大田中4。对苗床和苗圃 接种在苗床或苗圃基质或土壤上开沟然后将接种剂条播到沟内最终播种5对 大田接种开沟后可将接种剂撒播到沟内，然后再播种，这样可以削减接种剂用量。如地表撒播，然后耙入土内，接种物用量较多。国外已有用飞机撒播接种物，这在飞播造林上是常用的方法。三、其他接种方法1大田直接定植养分钵接种法将菌剂参与养分钵并播种后直接将其按确定株行距定植到大田中这样可以省去养分钵育苗过程由于菌剂被限制在养分钵内可以大大提高侵染速率和侵染强度从而增加接种菌 根真菌的效果。2。多菌混合接种法所谓多菌混合接种法是指同时将两种或两种以 上丛枝菌根真菌的接种剂施加到要进展接种处理的土壤或植物上有时也指将丛枝菌 根真菌与外生菌根真菌根瘤菌解磷或解钾细菌其他生防细菌或真菌等同时混合接 种，这是科研上针对不同试验目的承受的方法。3。掩盖作物接种法即幼龄果园一般间作花生、大豆、地瓜、三叶草、玉米、小麦等。这些间作物都适合于丛枝菌根真菌的侵染。因此在果园间作作物播种同时接种菌根，生长确定阶段后可增加土壤中丛 枝菌根真菌的数量削减土壤中病原物的数量从而改善建果园土壤中微生物区系组 成和土壤安康状况作物收获后大局部根系保存于土壤中由于这些根系都形成了