遗传病诊断课件

1、遗传病的诊断陈小义605780621023100遗传病的诊断（diagnosis of hereditary disease）指根据患者的临床症状、体征及辅助检查结果并结合遗传学分析，判定是否患有某种遗传病及遗传方式。遗传病的诊断概念方法临床上遗传学诊断方法包括：临床诊断、症状前诊断（presymptomatic diagnosis）、产前诊断和植入前诊断（preimplantation diagnosis）。陈小义605780621023100遗传病的诊断第一节 遗传病的临床诊断第二节 细胞遗传学检查第三节 生化检查第四节 产前诊断第五节 基因诊断陈小义605780621023100第一节

2、遗传病的临床诊断一、临床诊断的概念 临床诊断（symptomatic diagnosis）是指结合遗传咨询对患者的病史、症状、体征和实验室检查结果进行综合分析，确定诊断并判断遗传方式。陈小义605780621023100二、临床诊断的内容1.病史 除应了解一般病史外，还应着重采集与遗传病家族聚集现象有关的以下项目：家族史：整个家系患同种疾病的病史，能充分反映患者父系和母系各家族成员发病情况。婚姻史：结婚的年龄、次数、配偶的健康状况及是否为近亲婚配。生育史：生育年龄、子女数及其健康状况，有无流产、死产、早产史、畸胎等。陈小义605780621023100二、临床诊断的内容3.家系分析系谱分析是单

3、基因遗传病不可或缺的遗传分析方式。（1）系谱的系统性、完整性和可靠性。（2）部分显性遗传病具有延迟显性、外显不全和不规则显性的特点。（3）新的基因突变、遗传异质性对系谱分析的影响。陈小义605780621023100第一节 遗传病的临床诊断第二节 细胞遗传学检查第三节 生化检查第四节 产前诊断第五节 基因诊断陈小义605780621023100染色体检查指征：（1）明显智力发育不全者；（2）先天畸形、生长迟缓者；（3）夫妇之一有染色体异常，如平衡易位、嵌合体、结构重排等携带者；（4）有反复多次早期流产史的妇女及其丈夫；（5）原发闭经和女性不孕症；（6）两性内外生殖畸形者；（7）无精子症和男性不

4、育症；（8）家族中已有染色体异常或先天畸形的个体；（9）35岁以上高龄孕妇陈小义605780621023100二、性染色体检查X染色质检查：X染色质数目=X染色体数目-1。Y染色质检查：Y小体数目等于Y染色体数目， 取材：患者口腔粘膜脱落上皮细胞； 产前诊断：取羊水中胎儿上皮细胞涂片。陈小义605780621023100 类型 X染色质数目 Y染色质数目正常男性（XY） 0 1正常女性（XX） 1 0Turn综合征 （XO） 0 0Klinefelter综合征 （XXY） 1 1XYY综合征 0 2 XXX综合征 2 0陈小义605780621023100X染色体Y染色体13号染色体18号染色

5、体21号染色体陈小义60578062102310013号染色体21号染色体18三体综合征患者的FISH检测陈小义605780621023100第三节 生化检查一、蛋白质和酶的检测1. 常见遗传代谢病的酶活性检测 疾病遗传性缺陷酶采样组织苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶肝白化病酪氨酸酶毛囊组氨酸血症组氨酸酶指（趾）甲屑高苯丙氨酸血症二氢蝶啶还原酶成纤维细胞酪氨酸血症对羟苯丙酮酸羟化酶肝、肾酪氨酸血症酪氨酸氨基转移酶肝半乳糖血症半乳糖-1-磷酸-尿苷转移酶红细胞枫糖尿症支链酮酸脱羧酶肝、白细胞、成纤维细胞黑矇性痴呆氨基己糖酶白细胞Duchenne型肌营养不良肌酸磷酸激酶血清糖原贮积病型葡萄糖-6-磷酸酶肠

6、粘膜糖原贮积病型-1，4葡萄糖苷酶成纤维细胞糖原贮积病型红细胞脱支酶红细胞糖原贮积病型分支酶白细胞、成纤维细胞糖原贮积病型肝磷酸化酶白细胞陈小义605780621023100 假肥大型肌营养不良症（DMD）患者血清：磷酸肌酸激酶活性升高。 一、蛋白质和酶的检测血液特定的组织、细胞2. 材料来源第三节 生化检查陈小义605780621023100苯丙酮尿症酶活性检查苯丙氨酸羟化酶肝脏FeCl3显色反应苯丙酮酸绿色血液滤片法枯草杆菌抑制试验苯丙酮尿症（PKU）患者： 检测血清中苯丙氨酸或尿中苯丙酮酸、苯乙酸。二、代谢产物的检测陈小义605780621023100三、生化检查在临床诊断中的应用苯丙酮

7、尿症 典型PKU是由于患儿肝细胞缺乏苯丙氨酸-4-羟化酶（PAH），不能将苯丙氨酸转化为酪氨酸，在其合成和再生途径中必须经过鸟苷三磷酸环化水合酶（GTP-CH）、6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（6-PTS）和二氢生物蝶呤还原酶（DHPR）的催化。陈小义605780621023100诊断方法新生儿期筛查尿三氯化铁试验和2，4一二硝基苯肼试验血浆游离氨基酸分析和尿液有机酸分析尿蝶呤分析：陈小义6057806210231002. 型糖尿病发病（IDDM）与遗传有一定关系。3. 系统性红斑狼疮的发病原因，尚不完全清楚，一般认为是多基因遗传，可能与遗传、性激素、环境等多种因素相互作用造成机体免疫功能紊乱有关。

8、 陈小义605780621023100第四节 产前诊断产前诊断（prenatal or antenatal diagnosis）又称出生前诊断，是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作出诊断。 定义:产前诊断可以有效地预防遗传病患儿的出生，降低遗传病的发病率。陈小义605780621023100一、产前诊断的对象1.孕龄在35岁以上的高龄孕妇。2.夫妇一方有染色体异常，特别是表型正常的染色体平衡易位携带者或生育过染色体异常患儿的孕妇。3.曾生育过神管缺陷或先天畸形患儿的孕妇。4.夫妇之一患有先天性代谢病或生育过该病患儿的孕妇。5.X连锁隐性遗传致病基因携带者孕妇及常染色体显性遗传不

9、完全显性基因携带者孕妇。6.习惯性流产或有死胎、死产史的孕妇。7.夫妇之一有明显致畸因素接触史或服用不当药物的孕妇。陈小义6057806210231002. 绒毛取样术（妊娠9-12周）该方法对母体和胎儿比较安全，而且诊断时间较早，有利选择是否继续妊娠。陈小义6057806210231003. 脐带穿刺术（妊娠18周） 常用于血液系统疾病诊断、先天代谢疾病、染色体病等疾病的诊断。是绒毛和羊水检查可靠的补救措施。4. 超声波检查： 临床常用、首选的诊断方法。常用于神经管缺陷、外在发育畸形、先天性心脏病等器官组织发育畸形疾病的检测诊断。亦可作为取样、穿刺及胎儿镜查的主要辅助手段。5. 孕妇外周血分

10、离胎儿细胞陈小义6057806210231006. 胎儿镜检查 由于操作困难，产生并发症可能性大，故临床应用极少。7. X线检查对胎儿发育有明确的危害。8. 植入诊断陈小义605780621023100第一节 遗传病的临床诊断第二节 细胞遗传学检查第三节 生化检查第四节 产前诊断第五节 基因诊断陈小义605780621023100第五节 基因诊断定义：基因诊断（gene diagnosis）是指利用DNA分析技术直接从基因水平（DNA或RNA）检测遗传的基因缺陷，从而对疾病做出诊断。传统的诊断：表现型基因型 基 因 诊 断：基因型表现型 （ 逆向诊断）陈小义605780621023100基因诊

11、断特点：针对性强，特异性高检测灵敏度和精确性高实用性强，诊断范围广不受材料来源影响症状前诊断产前诊断陈小义605780621023100一、基因诊断的基本方法 1. 核酸分子杂交技术2. 聚合酶链反应 (PCR)3. 基因测序4. 基因芯片陈小义6057806210231001. 核酸分子杂交技术（1）Southern 印迹杂交： 直接检测致病基因内部的突变，如缺失、插入、倒位以及限制性内切酶酶切位点的改变。限制性片段长度多态性（RFLP）连锁分析： 进行致病基因遗传标记连锁分析，需结合家系图谱进行连锁分析，判断基因型。 （2）斑点印迹杂交：检测样品中核酸量的高低。陈小义60578062102

12、3100（4）等位基因特异性寡核苷酸（ASO）杂交法: 主要是根据已知基因突变位点、设计、制备与野生型或突变型基因序列互补的基因探针，经过杂交结果分析是否存在基因突变，判断基因类型。 （3）荧光原位杂交（FISH）技术： 用于检测染色体异常和染色体基因定位，可直接在细胞核中或染色体上确定DNA顺序，广泛应用于肿瘤、遗传病的基因诊断。 陈小义6057806210231002. 聚合酶链反应（PCR）技术 （1）PCR-RFLP：将聚合酶链反应（PCR）与限制性片段长度多态性（RFLP）分析方法相结合的一种检测技术。 在相应酶切位点两侧设计PCR引物，扩增目标DNA； 酶切PCR产物，检测产物中是

13、否含有酶切位点； 电泳分离酶切后PCR产物，根据电泳图谱结合家系图谱进行分析判断。 （2）PCR-SSCP：单链构象多态性（single -strand conformation polymorphism，SSCP）是一种检测核酸序列中点突变的技术。 基本原理是提取含有突变位点的DNA片段，当双链DNA变性为两条单链后，会在中性条件下形成不同空间构象，导致电泳的泳动速度不同，从而鉴定有无基因突变。陈小义605780621023100（3）PCR-ASO：将扩增DNA片段分别与野生型和突变型探针杂交，根据检测标本与两种探针杂交信号的区别，确定是否存在基因突变，分析受检者的基因型。 （4）RT-P

14、CR：主要用于基因表达水平的检测和分析。 陈小义6057806210231003. DNA 测序方法优点：快速、准确、微量、分辨率高、重复性好。4. 基因芯片技术优点：微量化、高通量、并行化和高度自动化，可适用于多个基因、多个位点的同时检测。基因突变、基因的多态性，组织细胞的基因表达情况。陈小义605780621023100二、基因诊断的主要途径1. 直接诊断通常使用基因本身或侧翼序列的DNA作为探针直接探查基因有无突变、缺失、重复等异常，是否存在表达的改变。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。陈小义6057806210231002. 间接诊断DNA 多态标记系统是否和致病基因具有高度相关性，是

15、是否采用此方法进行相关基因诊断的依据。 遗传标记相关基因表型分析陈小义605780621023100基因异常方法 探针、引物或限制酶基因缺失基因组DNA印迹杂交 缺失基因的探针PCR扩增 引物包括缺失或在缺失部位内点突变RFLP分析 突变导致其切点消失的限制酶ASO杂交 正常和异常的ASO探针PCR产物的多态性分析（RFLP、SSCP、DGGF） 引物包括突变部位基因已知但异常不明基因内或旁侧序列多态性（RFLP、AML-FLP，SSCP）连锁分析 基因内或旁侧序列探针或引物基因未知与疾病连锁的多态性，如SSCP、AML-FLP连锁分析、RFLP位点单体型连锁分析 与疾病连锁的多态位点探针或引

16、物遗传病的基因诊断方法 陈小义605780621023100三、基因诊断技术的应用1. PCR技术诊断遗传病 途径：基因突变位点的直接检出筛查与遗传病有关的点突变遗传多态性标记连锁分析间接诊断利用mRNA逆转录为cDNA进行分析或直接分析mRNA 进行PCR检测，除了具备酶，底物及其它基本因素外，遗传病的基因结构必须部分或全部清楚。 陈小义605780621023100(1) PCR技术直接诊断遗传病 基因缺失突变 基因的重排 突变位点不清楚或突变位点多变的基因 基因点突变影响到限制内性切酶切点 陈小义605780621023100(2) 利用连锁分析间接诊断遗传病 PCR-RFLP PCR扩

17、增后用相应的内切酶进行切割相应的扩增产物，通过用琼脂糖凝胶或聚丙烯胺凝胶电泳技术进行电泳，分析酶切位点多态性，在家庭间进行连锁分析。 陈小义605780621023100正常个体杂合子纯合子分子杂交法检测RFLP示意图 陈小义605780621023100 Amp-FLP VNTR(数目可变的串联重复序列STR(短的串联重复序列) 目前已广泛应用多种遗传病的连锁分析如DMD/BMD，PKU等。 选择合适的特异性诊断探针和诊断方法是遗传病基因诊断成败的关键。 陈小义6057806210231002. 基因芯片技术在遗传病诊断中的应用(1) 基因芯片的工作原理(2)基因芯片的应用 P53基因芯片

18、卵巢癌中基因表达谱 乳腺癌基因BRCA1的exon11(3.45kb)中所有可能的碱基置换、插入和缺失(15bp)突变 基因表达图谱 基因多态位点及基因突变的检测芯片杂交测序技术 陈小义605780621023100四、遗传病基因诊断举例1甲型血友病的分子遗传学研究 由凝血因子缺乏所引起的出血性疾病，呈X连锁隐性遗传。基因长约180kb，位于Xq28，含有26个外显子。成熟蛋白质包含2332个氨基酸，分子量约265kDa。因子的生理作用是作为X因子的辅助因子，被活化的因子(Fa)激活，从而将血液凝固的信号放大许多倍。 陈小义605780621023100（1）甲型血友病的基因突变类型基因重排单碱基置换缺失插入（2）突变检测直接检测突变内含子22基因重排的检测应用DNA多态性进行遗传学分析限制性内切酶片段长度多态性短串联重复顺序(STR)可变数目的串联重复顺序(VNTR) 陈小义605780621023