微生物遗传变异与育种

1、关于微生物遗传变异与育种第1页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（1）遗传型（基因型）某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因的总和 。（亲代与子代相似）（3）表型（表现型）某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。（2）变异 生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变 。（亲代与子代、子代间不同个体不完全相同） 变异了的微生物与原来的微生物有所不同，称为变种。遗传变异的几个基本概念第2页，共129页，20

2、22年，5月20日，18点28分，星期三（4）表型饰变即外表的修饰性发生改变。是一种不涉及遗传物质结构发生改变而只发生在转录、转译水平上的表形变化。特点：表型的差异只与环境有关,暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。如：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变。特点：遗传性、群体中极少数个体的行为。 （自发突变频率通常为10-610-9）第3页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三遗传学的模式生物微生物的独特生物学特性：（1）个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的

3、组合培养基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（8）易于形成营养缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；（10) 存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式。第4页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三第七章 微生物的遗传变异和育种第一节 遗传变异的物质基础第二节 基因突变和诱变育种第三节 基因重组和杂交育种第四节 基因工程第五节 菌种的衰退、复壮和保藏第5页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三第一节 遗传变异的物质基

4、础一、遗传变异的物质基础二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式第6页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质转化实验噬菌体感染实验植物病毒的重建实验遗传变异的物质基础是核酸。这个结论的得出就是以微生物为研究对象而得来的。一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验第7页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 （一）核酸存在的七个水平细胞水平细胞核水平染色体水平 核酸水平基因水平密码子水平核苷酸水平二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式第8页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 1. 细胞水平大部分DNA集中

5、在细胞核或核区。不同微生物或同种微生物的不同细胞中细胞核数目常不同。2. 细胞核水平真核与原核，被称为核基因组、核染色体或基因组。多数存在核外DNA含量少、能自主复制的核外染色体质粒。第9页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三3. 染色体水平（1）染色体数：不同生物染色体数目差别很大。（2）染色体倍数自然界中微生物染色体多为（n），只有少数营养细胞及合子为（2n）原核生物通过转化、转导或接合可形成不稳定的部分（2n）。4. 核酸水平（1）核酸种类（2）核酸结构（3）DNA长度即基因组的大小，可用bp、kb、mb表示。不同微生物基因组大小差别很大。第10页，共129页，20

6、22年，5月20日，18点28分，星期三5. 基因水平原核生物的基因组成以下调控系统而发挥作用： 启动基因（启动子） 操纵子 操纵基因基因调控系统 结构基因 调节基因6. 密码子水平遗传密码就是指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序。7. 核苷酸水平AMP、TMP、GMP、CMP，E.coli的T偶数噬菌体的DNA中有5羟甲基胞嘧啶。第11页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（二）原核生物的质粒质粒电镜照片 凡游离于原核生物 基因组外，具有独 立复制能力的小型 共价闭合环状的 dsDNA分子，称为 质粒。第12页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三1

7、、质粒的分子结构通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb（细菌质粒多在10kb以内）。第13页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三2、质粒的特征（1）形状大小：超螺旋结构、106 108Da、1%核基因组大小。 （2）数量：每个菌体内有一个或几个、或很多。（3） 质粒上携带有某些核基因组上所没有的基因，使原核生物的生长繁殖过程中增添了一些特殊功能，如：接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶、降解毒物等。（4） 是一种独

8、立存在于细胞内的复制子。严紧型复制控制：复制行为与核染色体的复制同步。松弛型复制控制：复制行为与核染色体的复制不同步。第14页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三2、质粒的特征（5） 少数质粒可在不同菌株间转移，如：F因子、R因子。（6） 质粒消除：因某些理化因素的影响致使质粒复制受抑而核染色体的复制仍继续进行，从而引起子代细胞中不带质粒的现象。（7） 有些质粒具有与核染色体整合和脱离的功能附加体。（8） 质粒还有重组的功能：可在质粒与质粒间、质粒与核染色体间发生基因重组。可用作基因工程的载体。第15页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三3、质粒的种

9、类（质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应）第16页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（1）F因子（fertility factor 致育因子、性因子）是E.coli等细菌决定性别并有转移能力的质粒。 （2）R因子（resistance factor） 又称R质粒 存在于某些肠道细菌中的抗药性质粒，这些细菌不仅能抗多种抗生素等药物，抗重金属等离子（汞、镉、镍、钴、锌、砷），还能把抗药基因传递到其他肠道细菌中。（3）Col因子（ colicinogenic factor大肠杆菌素质粒、大肠杆菌素因子）使E.coli等细菌产生大肠杆菌素等细菌素，具有通过抑制复制、转录、转译或

10、能量代谢等方式专一地抑制或杀死其他肠道细菌生长。4、几种典型质粒 第17页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（5） Ri质粒 发根土壤杆菌或发根农杆菌中，可侵染双子叶植物的根部，并诱生大量毛状的不定根。（7）降解性质粒（代谢质粒 ）假单胞菌中发现，可为降解一系列复杂有机物的酶编码。在污水处理、环境保护等方面有特有作用。（6）巨大质粒（ mega质粒）根瘤菌中，其上有一系列与固氮相关的基因。（4）Ti质粒 即诱癌质粒 存在于根癌杆菌中，可引起许多双子叶植物根癌。 第18页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三第二节 基因突变和诱变育种一、 基因突变二、

11、突变与育种第19页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三一、 基因突变（突变）是变异的一类。凡指细胞内或病毒粒内遗传物质的分子结构突然发生的可遗传的变化。可自发或诱导产生。狭义的突变：专指基因突变（点突变）。广义的突变：包括基因突变和染色体突变。突变的几率：很低10-6 -10-9。野生型菌株（wild type strain，野生型）：从自然界分离到的、没有发生过突变的菌株。突变株（mutant，突变体、突变型）：野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。第20页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 条件致死突变型（株）（一）突变类型 突变株的表型选择性

12、突变株非选择性突变株营养缺陷型（株）抗性突变型（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）突变的类型很多，按突变后极少数突变株的表型能否在选择培养基上迅速选出和鉴别，可分为：第21页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三1. 营养缺陷型（auxotroph） 某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基（minimum medium，MM）上正常生长繁殖的变异类型。2. 抗性突变型（resistant mutant） 野生菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。3. 条件致死突变型（

13、conditional lethal mutant） 某菌株经基因突变后，在某种条件下可正常地生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变类型。如：温度敏感突变株（Ts突变株）。第22页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三4. 形态突变型（morphological mutant） 由基因突变引起的个体或菌落形态的变异类型。5. 抗原突变型（antigenic mutant） 由基因突变引起的细胞抗原结构发生变化的变异类型。6. 产量突变型（metabolite quantitative mutant） 因基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。若产量

14、明显高于原始菌株者，称为正突变；反之称负突变。第23页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（二） 基因突变的特点1. 自发性：可自发地发生突变。2. 不对应性：突变性状与引起的原因间无直接对应关系。3. 稀有性：通常自发突变的频率在10-6 -10-9间。4.独立性：某基因的突变率不受他种基因突变率的影响。5.可诱变性：自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提高（10 -105倍）。6.稳定性：基因突变后的新遗传性状是稳定的。7.可逆性：野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生相反的回复突变。第24页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（三）基因突变

15、自发性和不对应性的证明变 量 试 验 涂 布 试 验 影印培养试验 第25页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成50小管)(在同一个大管中作整体培养) 3 7 1 4 4 3 5 抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数变量试验 甲管乙管噬菌体起淘汰原始未突变株和鉴别抗噬菌体突变株的作用。（10mL）（10mL）第26页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三涂布试验 涂布敏感菌5104个共12个平板5104个菌落5000个细菌/菌落喷入T1保温重新涂布后 喷入T1保温6个平板共353个菌落 6个平板共28个菌落噬菌

16、体的加入只起鉴别抗噬菌体的自发突变是否发生。E.coli第27页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三影印培养无药培养基含药培养基影印培养试验 原始敏感菌种证明微生物的抗药性突变是在接触药物前自发产生的，且这一突变与相应的药物毫不相干。E.coli第28页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三第29页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变。基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。突变自发突变诱 变环境因素的影响，DNA

17、复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9 。某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。（四）基因突变及其机制基因突变的机制是多样性的，可以是自发的或诱发的。第30页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三1、诱发突变（诱变）指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。诱变剂的种类很多，有物理因素（UV、激光、离子束、X射线、射线、快中子）和化学因素（亚硝酸、氮芥、烷化剂、碱基类似物、吖啶类化合物）。 第31页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，

18、星期三诱变机制 第32页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（五） 紫外线对DNA的损伤及其修复已知的DNA损伤类型很多，机体对其修复方法各异。1. 紫外线对DNA的损伤 DNA中嘧啶对UV的敏感性较强，经UV照射后相邻嘧啶会形成嘧啶二聚体（TT，TC，CC）和水合物。形成二聚体后，造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。第33页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三2. 微生物修复受损DNA的作用（1） 光复活作用 把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下， 就可出现明显降低其死亡率的现象。对照：8106个/ml E.coli 100

19、个/ml E.coli实验：8106个/ml E.coli 2106个/ml E.coli UVUV 360490nm可见光，30min第34页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三光复活作用机制： 经UV照射后带有嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶（光解酶、光裂合酶）结合。这种复合物在300 500 nm可见光下时，此酶会因获得光能而激活，并使二聚体分解成单体。同时光解酶也会从复合物中释放出来，以便从新执行功能。第35页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（2）切除修复（暗修复） 是活细胞内一种不依赖可见光就可对被紫外线等诱变剂损伤后的

20、DNA进行修复的方式。作用机制：通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸。在整个修复过程中，共有四种酶参与。第36页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三二、突变与育种自发突变与育种从生产中选育定向培育优良品种诱变育种 诱变育种的原则诱变育种的基本环节第37页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（一） 自发突变与育种 1.从生产中育种 生产中，自发突变的微生物中有可能出现一定几率的正突变。 2.定向培育优良菌株 是一种利用微生物的自发突变，并采用特定的选择条件，不断地移植以选育出较优良菌株的古老方法。 如：炭疽芽孢杆菌活菌苗、卡介

21、苗的选育。 缺点：费时费力、工作被动、效果很难预测。第38页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（二） 诱变育种利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速高效的筛选方法从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验和生产实践用。方法简便易行、条件和设备要求简单。诱变育种具有极其重要的实践意义。在当前发酵工业或其他大规模的生产实践中，大部分菌种为诱变而产生的变异菌株。第39页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 效价：指有效成分的浓度。1ug/ml 称为1 单位1945时间1943194319431

22、947195519711977目 前发酵单位( Uml1)100250500 850 850 80002 万5万 5万10万 从青霉素产量看诱变育种第40页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三1、诱变育种的基本环节大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率多数幅度小少数幅度大高产率投产率多数不宜投产少数适宜投产出发菌株计算出诱变第41页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三2、诱变育种工作中应考虑的几个原则挑选优良的出发菌株选择简便有效的诱变剂处理单细胞或单孢子悬液选用最适剂量的诱变剂设计或采用高效筛选方案或方法充分利用复合处理

23、的协同效应利用和创造形态，生理与产量间的相关指标第42页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三诱变剂的种类很多，有物理因素和化学因素两类。拟辐射物质：除了能诱发点突变，还能诱发一般只有辐射才能引起的染色体畸变这类DNA的大损伤的物质。如：氮芥、硫芥和环氧乙烷等。在选用理化因素作诱变剂时 ，在同样效果下，应选用最简便的因素；而在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。（1）选择简便有效的诱变剂第43页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三出发菌株菌体的稀释液接种培养接种分离紫外线使用UV照射最为方便。取5ml单细胞悬液置于直径6cm的培养皿中，开盖照射； 时

24、间不短于10 20s，也不长于10 20min。挑选优良菌株15W、30cm5mL第44页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三使用化学诱变剂的十分简便的方法： 平板上涂布出发菌株 在其上分区并放置诱变剂颗粒或沾有诱变剂溶液的小滤纸片 保温培养 诱变剂周围有一透明的制菌圈，在制菌圈的边缘存在有若干突变株的菌落 一一制成菌悬液 分别涂布在琼脂平板表面并保温培养 长成大量单菌落 选出所需突变菌株。第45页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三化学诱变剂的使用：化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是终止反应的方法很多。出发菌株含诱变剂的液体培养基接种培养培养接

25、种分离选择优良突变株第46页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三艾姆斯试验 原理：致癌物与诱变剂具有很高的相关性，能提高营养缺陷型的回复突变率的可疑物是诱变剂，所以很可能是致癌物。 作用：测定潜在的化学致癌物。 主要材料：沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株（还应是DNA修复酶的缺陷型）或大肠杆菌色氨酸缺陷型菌株第47页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三S.t.his回变S.t.his 吸入滤纸片保温可疑“三致”试样 鼠肝匀浆（含羟化酶）阳性阴性 利用回变检测致癌剂 艾姆斯试验法艾姆斯试验法广泛用于检测食品、饮料、药品、饮水和环境等试样中的致癌物第48页，共1

26、29页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（2）挑选优良的出发菌株生产中用过的自发变异菌株采用具有有利性状的菌株采用已发生其他变异的菌株采用对诱变剂敏感性较高的增变菌株出发菌株即用于育种的原始菌株。选用合适的出发菌株有利于提高诱变效率。 第49页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（3）处理单细胞或单孢子悬液用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细孢放线菌，霉菌应处理孢子细菌指数期，芽孢菌应处理芽胞出发菌株应制成均匀悬液使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长出不纯菌落。第50页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（4）选用最适的诱变剂量剂量：以诱变剂浓

27、度和处理时间来表示。合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正 变范围的剂量。第51页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（5）充分利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂先后使用同种诱变剂重复使用两种或多种诱变剂同时使用诱变剂的复合使用常表现明显的协同效应，有利于育种。第52页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（6）利用和创造形态，生理与产量间的相关指标淀粉酶变色圈试验变色圈大的为淀粉酶高产菌落第53页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（7）设计或采用高效筛选方案或方法一个出发菌株诱变剂处理选出200个单 单孢子菌株初筛（每

28、株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株第一轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株40株40株40株40株40株诱变剂处理第54页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三3、三类突变株的筛选方法 高产突变菌株的筛选方法 抗药性突变株的筛选方法 营养缺陷型的的筛选方法 第55页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三诱变 春日霉素产生菌的孢子悬液春日霉素高产菌种琼脂块培养法筛选 （1）产量突变株的筛选含供试菌种（拮抗对象）的琼脂平板 优点：在此条件下，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散

29、到琼脂块外，因此测得的结果与摇瓶实验结果十分相似，而工作效率却大为提高。红点为抑菌圈第56页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三含异烟肼接敏感菌含突变株（2）抗药性突变株的筛选方法梯度培养皿法 是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法。 用此法筛选抗异烟肼的吡哆醇高产菌株。 利用梯度平板法筛选抗代谢类似物突变株，可达到定向培育的目的第57页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三1）与营养缺陷突变株的筛选相关的几个概念相关培养基基本培养基 -完全培养基 + 补充培养基 A或B等 三类遗传型野生型 A+B+营养缺陷型 A+B-原养型 A+B+（3）营养缺陷型突

30、变株的筛选第58页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三与营养要求有关的三类遗传型第59页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三2）营养缺陷型的筛选办法诱变剂处理淘汰野生型检出缺陷型夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印接种法鉴定缺陷型菌丝过滤法抗生素法第60页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 诱变剂处理：与一般诱变处理相同。 淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例较低（百分之几千分之几）。需选用适当的方法淘汰为数众多的野生型菌株，达到“浓缩”极少数营养缺陷型的目的。抗生素法：青霉素法（适用于细菌）、制霉菌素法（适用

31、于真菌）等方法。菌丝过滤法：用滤孔较大的擦镜纸过滤。适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。第61页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三夹层培养法（同一培养皿）小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）检出营养缺陷型：具体方法很多。 用含有特定生长因子的基本培养基作第四层可直接分离到相应的营养缺陷型第62页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三限量补充培养法（同一培养皿） 微量蛋白胨的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株若想获得某一特定营养缺陷型突变株，只要在基本培养基上加入微量的相应物质就可以达到。野生型细胞能迅速长成大的菌落，而营养缺陷型则因营养受限制生长缓

32、慢。第63页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 逐个检出法（两个培养皿）涂布培养基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落含诱变剂的液体培养基菌种营养缺陷型第64页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三影印接种法（两个培养皿）第65页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三鉴定缺陷型：可生用长谱法进行鉴定。 缺陷型菌株生长谱测定第66页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三第三节 基因重组和杂交育种基因重组（遗传重组，重组）：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。重组是在核

33、酸分子水平上的一个概念，而杂交是在细胞水平上进行的，但其中包含了核酸分子水平上的重组。基因重组是杂交育种的理论基础。微生物基因重组的形式较多。 第67页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三一、原核生物的基因重组二、真核微生物的基因重组第68页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三一、原核生物的基因重组原核生物的基因重组形式很多：转化、转导、接合、原生质体融合。其特点为： 1. 片段性，仅一小段DNA序列参与重组； 2. 单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因向受体基因）作单方向转移； 3. 转移机制独特而多样，如接合、转化和转导。第69页，共129页

34、，2022年，5月20日，18点28分，星期三 （一） 转化(transformation) 1定义 受体菌（recipient cell,receptor）直接吸收供体菌（donor cell）的DNA片段并把它整合到自己的基因组中，而获得供体菌部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子。（transformant）。2. 转化微生物的种类 种类十分普遍：原核生物，真核微生物。不需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触的基因重组方式 第70页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三1）感受态（competence） 指受体细胞最易接受外源D

35、NA片段并能实现转化的一种生理状态。 在细菌的感受态出现时，具有从周围环境吸收DNA分子而不被DNA酶破坏的生理特性。处于感受态的细胞，吸收DNA的能力有时可比一般细胞大1000倍。 3. 转化条件（1） 亲缘关系：多同缘DNA。（2）能进行转化的细胞必须是感受态的。第71页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三2） 与感受态的出现有关的因素 受该菌遗传性、菌令、生理状态和培养条件等影响。 一般出现在生长的指数期后期，有的出现在指数期末和稳定期；在具有感受态的微生物中，感受态细胞所占比例和维持时间也不同；外界环境因子如环腺苷酸（cAMP）及Ca2+ 等对感受态也有重要影响（

36、环腺苷酸可提高1000倍、Ca2+能促使细胞进入感受态）。3）感受态因子：是受体细胞表面上的调节感受态的一类特异蛋白（胞外蛋白），能使转化因子结合在受体细胞表面。 包括3种主要成分，即：膜相关DNA结合蛋白（membrane-associated DNA binding protein）,细胞壁自溶素（autolysin）和几种核酸酶。第72页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三不同微生物中，转化因子的形式不同。 自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，实验室里通过提取获得。双链有转化能力，单链没有。4. 转化因子（transforming principle） 来自供体菌的

37、DNA片段或质粒。 转化因子的本质是离体的DNA片段。通常为 15kb 左右的片段，质粒DNA也可。 第73页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三每个受体细胞表面约有30 80个转化因子结合点，当转化因子结合到受体表面结合点上时 ，DNA一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组，有人发现DNA也可通过双链形式进入受体细胞形成双倍体的转化子。5、转化过程转化过程被研究得较深入的是G+细菌肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）。 第74页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三转化过程第7

38、5页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三6、转化的特点 不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。6.转染（transfection）指用提纯的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。作为转染的病毒核酸，决不是作为供体基因的功能，被感染的宿主也决不是能形成转化子的受体菌。第76页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三转导的种类 通过缺陷噬菌体（defective phage）的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。 由转导

39、作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子（transductant）。 作为媒介的缺陷噬菌体可分为：完全缺陷噬菌体、部分缺陷噬菌体。(二)转导(transduction) 普遍转导（通过完全缺陷噬菌体）局限转导（通过部分缺陷噬菌体）需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触 第77页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三1完全缺陷噬菌体与普遍转导 （1） 完全缺陷噬菌体 感染宿主的噬菌体待成熟与进行包装之际，极少数噬菌体（约10-610-8个）的衣壳将与其头部DNA相似的一小段供体菌DNA片段误包入其中，因此形成了完全不含噬菌体本身DNA的假噬菌体完全缺陷噬菌体（转导颗粒，t

40、ransducing particle）。第78页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（2） 普遍转导（generalized transduction） 通过极少数完全缺陷噬菌体感染受体菌时，把供体菌DNA片段导入受体细胞内，而将供体菌的遗传性状传递给受体菌的现象，称为普通转导。 一般用温和噬菌体作为普通转导的媒介。 普通转导又可分为以下两种：完全普遍转导 、 流产普遍转导 第79页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三1）完全普遍转导 （简称普遍转导、完全转导 complete transduction） 由完全噬菌体导入的供体dsDNA片段可与受

41、体细胞核染色体组上的同缘区段配对，再通过双交换而整合到受体菌染色体组上，使受体菌成为一个遗传性状稳定的转导子。 外源dsDNA片段经双交换形成一稳定转导子示意图第80页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三转导模型由P22噬菌体引起的完全普遍转导 以Salmonell tyhimutium为例，用野生型菌株作供体菌，营养缺陷型突变株作受体菌，P22噬菌体作转导媒介：第81页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 2） 流产普遍转导（流产转导） 经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果外源DNA在其内即不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，只进行转录、

42、转译和表达的现象。第82页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三2. 部分缺陷噬菌体与局限转导 通过部分缺陷噬菌体的媒介把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与受体菌基因整合、重组，形成转导子的现象。（1） 部分缺陷噬菌体 前噬菌体脱离溶原菌的核基因组时，将其插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体的DNA上（而噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的核染色体组上），通过衣壳的误包就形成了一种特殊的噬菌体部分缺陷噬菌体。（2） 局限转导 由部分缺陷噬菌体转导的基因总是限于临近前噬菌体两侧的宿主基因，因此称为局限转导或限制性转导。 根据转导子出现的频率高低可以分为两类：低频

43、转导， 高频转导 第83页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 3、溶源转变（lysogenic conversion）一个与转导相似又不同的现象温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。（获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子）溶源转变与转导的不同：a）不携带任何供体菌的基因；b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；C）获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失.第84页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 (三)接合(conjugation)供体菌（F+）通过性菌毛与受体菌（F-）直接接触，把

44、F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，并使其获得若干新遗传性状的现象。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞叫接合子。大肠杆菌的接合能进行接合的微生物种类：主要在细菌和放线菌中进行.细菌中，尤其G-菌较为普遍。接合还可发生在不同属的一些菌种间。 第85页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三F因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上第86页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三F因子的四种存在方式a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；b）F+菌株， F因子

45、独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。 细胞表面同样有性菌毛。第87页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三雄性菌株 Hfr菌株 F 菌株 菌株 （雌株）4种因子的相互关系 F+ 菌株第88页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三三者根本区别在于DNA转移的方式不同 转化：供体菌DNA片断直接进入受体细胞。接合：供体菌DNA进入受体菌通过性菌毛。转导：供体菌DNA片断通过媒介噬菌体携带进入

46、 受体菌。 第89页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三(四)原生质体融合1. 原生质体融合 通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得具有双亲遗传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体融合。所获得的重组子叫融合子。2. 能进行原生质体融合的生物种类 原核生物和各种真核微生物和高等植物细胞。第90页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三3. 主要操作步骤 （1） 选选择亲本细胞置于等渗溶液中；（2） 用适当的脱壁酶除去细胞壁；（3） 将原生质体离心聚集，加入促融合剂PEG（聚乙二醇）；（4） 用等渗溶液稀释；（5） 涂在能促细胞

47、壁再生和进行细胞分裂的基本培养基上；（6） 用影印平板法将形成的菌落接种到各种选择性培养基平板上，检验其是否为稳定的重组子；（7） 测定其有关生物学性状和生产性能。原生质体融合的操作示意图第91页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三二、真核微生物的基因重组主要方式：有性杂交准性杂交原生质体融合（略）转化（略）真核微生物基因重组在有性繁殖过程中发生，当合子减数分裂时，两染色体发生交换。第92页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三（一）有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。 凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则

48、上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。第93页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三酵母菌的有性杂交育种（一）酵母菌的生活史（二）酵母菌有性杂交技术酵母菌有性杂交程序一般为：亲本的单倍化有性杂交杂交后代的检出筛选优良性状个体第94页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三S. Cerevisiae 的双倍体和单倍体细胞的比较项 目双倍体单倍体细 胞大，椭圆形小，球形菌 落大，形态均一小，形态变化较多液体培养繁殖快，细胞较分散繁殖较慢，细胞常聚集成团在产孢子培养基上 形成子囊及子囊孢子不形成子囊第95页，共129页，2022年，5月20

49、日，18点28分，星期三定义和意义：类似于有性生殖但更原始的生殖方式，是通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。为半知菌育种提供了一个重要手段。存在范围：常见于一些真菌尤其是半知菌中（二）准性生殖（parasexual hybridization）第96页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三准性生殖的过程：菌丝联结 异核体形成（质配） 核配形成杂合二倍体体细胞交换和单倍体化。第97页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三准性生殖与有性生殖的比较 项 目 准性生殖 有性生殖参与接合的亲本细胞 形态相同的

50、形态或生理上有 体细胞 分化的性细胞独立生活的异核体阶段 有 无接合后双倍体细胞形态 与单倍体 与单倍体 基本相同 明显不同双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂接合发生的几率 偶然发现， 正常出现， 几率低 几率高第98页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三准性杂交：选择亲本：以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本;强制异合：将两菌亲株的分生孢子（106107）混合涂-平板，并做各单亲本对照， -平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体;移单菌落：纯化菌落，并将纯化后的菌落移入-斜面;验稳定性：在-夹层平板上培养后，再倒上一层+，再培养后若出现大量新菌落，说明是不

51、稳定的异核体，反之是杂合二倍体;促进变异：用诱变剂进行处理，以促进染色体发生交换、染色体在子细胞分配不均、染色体缺失或畸变、点突变等，使分离后的子代提高增加新性状的可能;筛选：通过一系列生产性壮的测定。第99页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三Penicillum urticae 的准性杂交步骤第100页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三第四节 基因工程 一、 基因工程（遗传工程） 是一种人们利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度满足人类活动的需要的体外DNA重组

52、技术。第101页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三二、 基因工程的基本操作1、目的基因的取得2、优良载体的选择3、目的基因与载体 DNA的体外重组4、重组载体导入受体 细胞5、重组受体细胞的 筛选和鉴定6、“工程菌”或“工程 细胞”的大规模培养第102页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三三、 基因工程的应用1、在生产多肽类药物、疫苗中的应用2、改造传统发酵菌种 3、动、植物特性的基因工程改良4、基因工程在环境保护中的应用第103页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三一、菌种的衰退与复壮二、菌种保藏第五节 菌种的衰退、复壮和保

53、藏第104页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异b）污染c）死亡第105页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三一、菌种的衰退与复壮1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。大量群体中的自发突变（二）菌种的复壮a）纯种分离b）通过寄主体进行复壮（一）菌种衰退的特点第106页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，

54、星期三（三）防止衰退的措施1）减少传代次数2）创造良好的培养条件3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行 检查4）采用有效的菌种保藏方法第107页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 菌种是一个国家所拥有的重要生物资源。 菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作。 菌种保藏机构的任务是在广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株甚至动、植物细胞株和质粒等）的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 为此，在国际上一些工业较发达的国家中都设有相应的菌种保藏机构。例如：中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）美国典型菌种保藏中心（ATCC

55、） 二、菌种保藏第108页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异:(原理) 首先要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）； 其次还要创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。 第109页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥第110页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三

56、由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。第111页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三第112页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三在我国，菌种保藏一般用以下方法进行： 固体培养基斜面上定期移植法（4下保藏）； 石蜡油封藏法（室温下保藏）； 冷冻干燥保藏法（10下保藏）；

57、砂土法保藏； 液体超低温保藏法 此外，对丝状真菌则另加麦麸皮法保藏等。 第113页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三 在国际著名的美国ATCC（American Type Culture Collection）中，目前已改为仅采用两种最有效的方法，即保藏期一般达515年的冷冻干燥保藏法和保藏期一般达20年以上的液氮保藏法，以达到最大限度地减少传代次数和避免菌种衰退的目的。 第114页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三第115页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三复习思考题：1、5、6、9、13、14、15、16、17、20、22、23、26、28。第116页，共129页，2022年，5月20日，18点28分，星期三青霉素浓缩法培养基(含青霉素) 接入敏感菌液 （含抗性突变株）涂布抗青霉素菌落培