激活TRPM8通道对正常和慢性低氧肺高压大鼠肺动脉上钙池操纵性钙内流(SOCE)的调控

1、激活 TRPM8通道对正常和慢性低氧肺高压大鼠肺动脉上钙池操纵性钙内流（ SOCE）的调控肺高压（ pulmonary hypertension,PH）的显著特征是肺血管收缩增强和肺血管重塑 , 主要由肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth musclecells,PASMCs ）胞浆内游离 Ca2+浓度 (intracellularfree calciumconcentration,Ca2+i)的持续升高引起。研究表明,钙池操纵性钙通道 (store-operated Ca2+channel,SOCC)所介导的钙池操纵性钙内流（ store-operated c

2、alcium entry,SOCE）在特发性肺动脉高压（ idiopathicpulmonary arterialhypertension,IPAH）患者及 PH动物模型的 PASMCs中均显著增强 , 并且在 PH发展过程中发挥重要作用。研究表明 ,PH 大鼠模型 PASMCs中 melastatin相关的瞬时受体电位8（ melastatin-related transient receptor potential 8,TRPM8）的表达显著下调 , 并且激活 TRPM8通道后能够引起预收缩肺动脉 （pulmonary arteries,PAs）的舒张。然而 ,TRPM8通道诱导肺血管舒张

3、的机制尚不明确。本研究在常氧和慢性低氧性肺高压（chronic hypoxia-induced pulmonaryhypertension,CHPH ）大鼠模型基础上 , 首先检测 CHPH大鼠 PASMCs中 TRPM8和TRPC1表达和通道功能活性的变化, 以及 TRPC1介导的 SOCE功能的变化 , 进而观察 TRPM8通道激活对 SOCC特异性激动剂环匹阿尼酸 （cyclopiazonicacid,CPA ）和内皮素 -1（Endothelin-1,ET-1）诱导的大鼠 PAs收缩效应的影响 , 对 CPA诱导的大鼠 PASMCsCa2+i升高和 SOCE增强的影响 , 以及对CPA

4、诱导的大鼠和人PASMCs胞膜钙池操纵性阳离子电流(store-operatedcation current,ISOC)的影响。以期研究PH发展过程中 TRPM8和SOCE功能之间的关系 , 从而为 PH发病机制的阐明及其靶向治疗提供新的科研依据。第一部分激活 TRPM8通道对 SOCE介导的正常和慢性低氧肺高压大鼠肺动脉张力的作用目的 : 检测 CHPH大鼠中 TRPM8表达和 SOCE功能的变化 , 观察 TRPM8通道激活对 CPA和 ET-1 诱导的大鼠 PAs收缩效应的影响。方法 : 清洁级雄性 SD大鼠常压慢性低氧（ chronichypoxia,CH ）处理 3 周构建 CHPH

5、大鼠模型 , 在此基础上采用 : （ 1）血流动力学检测方法 , 利用米勒压力导管（ Mikro-Tip pressurecatheter ）测定大鼠右心室收缩压 （rightventricularsystolicpressure,RVSP ）和肺动脉平均压 (mean pulmonary arterial pressure,mPPa),分离右心室（rightventricular,RV）, 计算右心室重量指数 （rightventricularmassindex,RVMI ）的变化 ; （2）实时荧光定量 PCR和 Western blot检测方法 , 测定大鼠去内皮 PAs中 TRPM8和

6、 SOCC主要构成者经典瞬时感受器电位通道（1 canonicaltransient receptor potential,TRPC1）mRNA和蛋白的表达水平 ; （3）共聚焦免疫荧光法 , 测定 PASMCs中 TRPM8和 TRPC1通道蛋白的定位情况 , 计算荧光强度比较两者在 CHPH大鼠中的变化 ;（ 4）血管环张力检测方法 , 观察 TRPM8通道特异性激动剂 icilin对 SOCC特异性激动剂 CPA和 ET-1 诱导的大鼠 PAs收缩效应的影响 , 及在 CHPH大鼠中的变化。结果 : 与正常对照组（control,CON ）大鼠相比 ,（1）CHPH模型大鼠的 RVSP、

7、mPPa以及 RVMI均显著增高 , 提示 PH大鼠模型构建成功 ; （2）CHPH大鼠去内皮 PAs 中 TRPM8表达显著降低 , 而 TRPC1表达明显增高 , 提示在 PH的发展过程中 TRPM8和 TRPC1的表达及其通道功能的变化可能呈相反趋势（;3）PASMCs中 TRPM8和 TRPC1通道蛋白都广泛表达 , 且 CHPH大鼠 PASMCs中 TRPM8蛋白荧光强度显著降低 , 而 TRPC1蛋白荧光强度显著增高 , 与上述蛋白和基因表达结果一致 ;（4）CHPH大鼠中 CPA诱导的去内皮 PAs收缩效应显著增高 ,icilin剂量依赖性抑制 CPA诱导的 PAs收缩效应 ,

8、且抑制剂的抑制率在CHPH大鼠显著增加 , 而TRPM8通道特异性阻滞剂 AMTB能够逆转抑制剂的作用 , 提示 CHPH大鼠 PAs中 SOCE功能显著增强 , 激活 TRPM8通道能够抑制 SOCE;（5）单剂量 icilin（ 10M）抑制 CPA诱导的 PAs 收缩效应 , 且抑制率在 CHPH大鼠显著增加 , 在此基础上继续加入 SOCC特异性抑制剂钆离子 (gadolinium,Gd3+) 能够引起血管的进一步舒张 , 相反 , 在 Gd3+抑制 CPA诱导的 PAs收缩效应基础上继续加入 icilin 并没有引起血管的显著舒张 , 提示 TRPM8激活能够抑制 SOCE,且 ic

9、ilin舒张血管的作用可能包含在Gd3+的作用范围内 ; （6）CHPH大鼠中ET-1 诱导的 PAs收缩效应显著增高 , 且 icilin和 Gd3+对 ET-1 诱导的 PAs收缩效应舒张作用也明显增大, 同样 , 在 icilin舒张血管的基础上继续加入 Gd3+引起进一步的血管舒张 , 而 Gd3+作用基础上继续加入 icilin 并没有引起血管的进一步舒张 , 提示 CHPH模型大鼠 PAs上 ET-1的高反应性和 SOCE功能的增强 , 进一步表明激活 TRPM8通道能够抑制 ET-1 诱导的 SOCE,且 icilin 舒张血管的作用可能包含在 Gd3+的作用范围内。结论 :CH

10、 预处理 3 周能够成功诱导大鼠发生 PH和右心肥厚 ; 其机制可能是 CHPH大鼠 PASMCs中 TRPM8的表达降低 , 而 TRPC1的表达显著上调 , 引起 TRPC1所介导的 SOCE功能显著增强 , 且 TRPM8的下调使其对 SOCE功能的抑制作用减小 , 进一步引起 PASMCsCa2+i增高 ,PAs 血管收缩增强和血管重塑 , 促进 PH的发生发展。第二部分激活 TRPM8通道对正常和慢性低氧肺高压大鼠肺动脉平滑肌细胞SOCE的作用目的 : 观察 TRPM8通道激活对 CHPH模型大鼠PASMCsCa2+i的增加及 SOCE功能增强的影响 , 以进一步明确 TRPM8通道

11、激活对 SOCE功能的调控 , 及其在 PH发病过程中的作用。方法 :在 CHPH大鼠模型的基础上 , 采用 :（1）Mn2+淬灭 Fura-2 荧光检测方法 , 测定 icilin 和 CPA分别诱导大鼠 PASMCs胞膜 Ca2+内流速率的变化 , 以及 TRPM8通道激活对 CPA诱导的大鼠 PASMCs胞膜 Ca2+内流速率的影响 （;2）Fluo-3 荧光检测 PASMCsCa2+i方法 ,测定 TRPM8通道激活对 CPA诱导的大鼠 PASMCs胞膜静息Ca2+i 和 Ca2+内流的影响 ; （3）Fluo-3荧光检测 PASMCsCa2+i方法 , 不影响静息Ca2+i 和 Ca

12、2+释放条件下 , 测定 TRPM8通道激活对 CPA诱导的大鼠 PASMCs胞膜 Ca2+内流的影响。结果 : 与正常大鼠相比 , （1）CHPH模型大鼠中 ,icilin诱导的 PASMCs胞膜Mn2+淬灭最大速率显著降低 , 且加入 Mn2+500s后荧光信号降低的百分比也显著降低, 相反 ,CPA诱导的 Mn2+淬灭最大速率显著增大 , 加入 Mn2+500s后荧光信号降低的百分比也显著增加, 提示 TRPM8通道功能活性在 CHPH大鼠中显著降低 , 而 SOCE功能增强 ; （ 2） TRPM8通道激活能够显著抑制CPA诱导的 Mn2+淬灭最大速率 , 以及加入Mn2+500s后荧

13、光信号降低的百分比, 且抑制率在 CHPH大鼠中更大 ,提示 PASMCs中 TRPM8通道激活能够显著抑制SOCE的功能 ; （3）TRPM8通道激活能够显著抑制 CPA诱导的 PASMCs胞膜 Ca2+i 升高作用 ,且抑制率在 CHPH大鼠中更显著 , 而 TRPM8通道特异性阻滞剂AMTB能够逆转抑制剂的抑制作用 , 更直接的表明激活TRPM8通道能够抑制 SOCE功能 ; （4）TRPM8通道激活能够显著抑制CPA诱导的 PASMCs胞膜静息Ca2+i 水平 , 且抑制率在 CHPH大鼠中更显著 , 而icilin对 Ca2+释放无显著抑制作用 , 进一步提示 PASMCs中 TRP

14、M8通道激活抑制 SOCE功能 ; （5）PASMCs静息 Ca2+i 正常水平下 ,icilin干预后同样显著抑制CPA诱导的 Ca2+内流。结论 :CHPH大鼠 PASMCs中 TRPM8通道功能显著降低 ,SOCE功能显著增强。TRPM8通道激活后显著抑制 PH大鼠 PASMCs中Ca2+i 的增加及 SOCE功能的增强。第三部分激活TRPM8通道对正常大鼠和人肺动脉平滑肌细胞钙池操纵性阳离子电流的作用目的 : 观察 TRPM8通道激活对正常大鼠和人PASMCs胞膜 SOCC介导的ISOC的影响 , 进一步明确 TRPM8通道激活对 SOCE功能的调控。方法 : 在正常大鼠和人PASMC

15、s上, 采用 :（1）全细胞膜片钳技术 , 测定 icilin和 Gd3+分别对 CPA诱导的正常大鼠 PASMCs胞膜 ISOC的影响 ; （2）全细胞膜片钳技术 , 测定 icilin和 Gd3+分别对 CPA诱导的人 PASMCs（ HPASMCs）胞膜 ISOC的影响。结果 : （1）正常大鼠中 , 成功记录到 CPA诱导的 PASMCs胞膜 ISOC,SOCC特异性抑制剂Gd3+显著抑制 ISOC,而且 TRPM8通道特异性激动剂icilin呈剂量依赖性抑制ISOC,提示 PASMCs中 TRPM8通道激活能够显著抑制 ISOC;（ 2）正常大鼠中 , 单剂量 icilin显著抑制

16、PASMCs胞膜 ISOC,在此基础上继续加入Gd3+后能够引起ISOC的进一步降低 , 再次提示 TRPM8通道激活能够抑制ISOC,且 icilin抑制 ISOC的作用可能包含在Gd3+的作用范围内 ; （3）HPASMCs中,icilin和 Gd3+均能够显著抑制 CPA诱导的 ISOC,同样 , 在 icilin作用的基础上 ,Gd3+能够引起 ISOC的进一步降低 , 提示在 HPASMCs中激活 TRPM8通道同样可以抑制ISOC,再次表明 icilin抑制ISOC的作用可能包含在Gd3+的抑制作用范围内。结论 : 在大鼠和人的 PASMCs中, 激活 TRPM8通道均能够显著抑制

17、CPA诱导的ISOC,更直观的表明 TRPM8通道激活与 SOCE功能的调控关系密切。表明 icilin可能通过激活 TRPM8抑制大鼠 PASMCs和 HPASMCs胞膜ISOC,抑制 SOCE的功能 , 从而舒张激动剂诱导的大鼠PAs的收缩效应 ,抑制 PASMCs胞膜 Ca2+内流速率和 Ca2+i 。综上所述 ,PASMCs中 TRPM8表达和功能活性的降低以及SOCE功能的上调在CHPH致病过程中发挥了重要作用。CH通过上调 SOCC主要构成者 TRPC1的表达 ,引起 TRPC1所介导的 SOCE功能显著增强 , 且 TRPM8的下调使其对 SOCE功能的抑制作用减小 , 进而引起 PASMCsCa2+i增